1.서 론

2015년 국토 교통부의 통계에 따르면 국내 자동차 등록대수는 2천만대를 넘어가는 것으로 집계되었다. 이처럼 국내 자동차 보유율이 증가하고, 자동차 실내에 서 보내는 시간이 증가함에 따라 자동차 실내 공기질 에도 관심이 높아지고 있다. 일반적인 실외 대기환경과 비교하면, 자동차의 실내 공기질에는 휘발성 유기화합 물(volatile organic compounds, VOCs), 미세입자(fine particle, PM), 다환 방향족탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs), 지방산, 황화합물 등의 오염물질 이 상대적으로 높은 농도로 존재한다(Park and Kim, 2014). 이러한 오염물질은 환기, 난방 및 냉방을 담당 하는 HVAC 시스템(heating, ventilation, and air conditioning systems)을 통해 자동차 실내 공기질을 더욱 악 화시킨다(Park and Kim, 2014). 이 중에서도 특히 benzene, toluene, xylene과 같은 휘발성 유기화합물, 지방 산, 황화합물 등의 물질은 대표적인 악취유발 물질로, 호흡기계 과민성질환을 유발할 수도 있는 유해한 실내 오염물질이다(Cha et al., 2011; Park and Kim, 2014). 휘발성 유기화합물은 보통 새 차 냄새, 불쾌한 기름 냄 새 등으로 표현되는 대표적인 자동차 악취물질이며, 저 농도에서도 악취를 유발할 뿐만 아니라 두통, 구토 및 어지럼증을 유발한다(Cha et al., 2011). 지방산은 땀냄 새 또는 젖은 신발 냄새 등의 시큼한 냄새를 풍기며, 황화합물은 계란, 양배추 등이 썩는 퀴퀴한 냄새 특성 을 지닌다(Park and Kim, 2014). 이러한 악취유발 물 질은 주로 미생물의 1차 및 2차 대사작용의 부산물로 생성되기 때문에 microbial volatile organic compounds (mVOCs) 라고 불리기도 한다(Korpi et al., 2009). 지 방산은 보통 미생물의 1차 대사작용의 부산물로 생성 이 되며, 황화합물은 시스테인, 시스틴, 메티오닌과 같 은 황함유 아미노산으로부터 2차 대사작용의 산물로 생성된다(Korpi et al., 2009). 일반적으로 자동차의 사 용연한이 증가할수록 오염물질이 HVAC 시스템 안에 서 응축하고, 이를 기질로 하여 HVAC 시스템 내 미생 물이 생물막을 형성하며 증식하게 된다(Rose et al., 2000). 이러한 미생물이 오염물질을 이용하는 과정에서 악취를 유발하는 대사산물을 생산하므로 HVAC 시스 템은 자동차 내 악취의 주요 발생원이다(Park and Kim, 2014). 따라서 자동차 악취를 제어하기 위해서는 HVAC 시스템에서 증식하는 미생물을 억제해야 하며, 이를 위한 미생물학적 정보가 필요하다. 이에 따라 자 동차 HVAC 시스템에서 악취와 연관된 미생물에 대한 연구는 국내외로 진행되고 있으나(Park and Kim, 2014), 대부분 미생물 동정에 그치고 있으며, 전체 미 생물 군집에 대한 연구 결과는 미약한 실정이다. 따라 서 이 연구에서는 DNA를 기반으로 시료 전체 유전체 정보인 메타게놈 분석법을 이용하여 자동차 HVAC 시 스템에 서식하는 세균 군집을 분석하고 그 특성을 고 찰하였다.

2.재료 및 방법

본 연구에서 사용된 HVAC 시스템은 1~5년 동안 운 행한 16대의 승용차로부터 분리하여 수집하였다. HVAC 시스템을 분리한 승용차는 주행거리가 35,000~ 100,000 km 범위인 출·퇴근용과 시험용으로 도심이나 시골지역, 또는 도심과 시골지역을 동시 운행한 것들로 다양하게 구성하였다. HVAC에 장착된 에어필터는 부 직포재질의 일반필터 10종과 활성탄 입자나 ACF (activated carbon fiber)가 들어있는 필터 6종이었다.

HVAC 시스템 내 악취 유발 세균의 군집을 분석하 기 위해 HVAC 시스템에서 시료를 채취하였다. HVAC 부품 중에서 유입 덕트, 필터, 블로워 모터, 증발기, 히 터코어 및 케이스 총 다섯 부분의 시스템이 시료 채취 에 사용되었다. 유입 덕트(Fig. 1a), 블로워 모터(Fig. 1c), 히터코어 및 케이스(Fig. 1f)는 멸균수에 적신 멸균 된 면봉으로 골고루 긁어 시료 채취를 하였고, 면봉이 닿지 않는 부분은 멸균수로 씻어내었다. 필터 부분은 멸균수로 적신 멸균 면봉으로 긁어 시료를 채취하고, 또한 필터의 일부분을 잘라 시료로 사용하였다(Fig. 1b). 증발기는 증발기의 냉각핀 표면을 멸균된 면봉으 로 골고루 긁어냈으며(Fig. 1d), 냉각핀의 일부를 절단 하여 시료를 채취하였다 (Fig. 1e). 각 부품으로부터 시 료 채취에 사용된 면봉 및 필터 조각은 50 mL의 conical tube에 담은 후, 멸균수를 20 mL 넣어 14°C에서 20 분간 초음파처리 하였다(40 kHz, BRANSON 8510, Emerson Electric Co., St. Louis, USA). 초음파 처리 후 30분간 정치시켜 고액분리를 하였고, 상등액 1 mL 를 멸균된 1.5 mL-Eppendorf tube에 넣어 10,000 rpm 에서 10분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 얻은 침 전물을 -20°C에서 보관하였다. 증발기의 냉각핀시료는 10 g에 멸균수 40 mL를 넣고 초음파 처리 후 얻은 상 등액을 유리섬유여지(GF/C, 47 mm in diameter, Whatman, Maidstone, United Kingdom)로 여과하였고, 여과 가 완료된 여지를 반으로 잘라 멸균된 2.0 mL-Eppendorf tube에 넣어 -20°C에서 보관하였다.

HVAC 시스템 내 일반 세균의 군집을 분석하기 위 해 상기한 방법으로 전처리하여 얻은 시료 (0.1~0.5 g) 를 이용하여 pyrosequencing을 수행하였다. NucleoSpin ® Soil Kit (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany) 와 BeadBeater-8 system (Biospec, Bartlesville, USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA 시료는 30 μL의 elution buffer로 추출하였으며, 추출한 DNA 는 ASP-2680 (ACTGene Inc., Piscataway, USA)를 이 용하여 농도를 확인 후 -20°C 에서 보관하였다. Pyrosequencing 분석을 위해 세균의 V3와 V4 region을 포 함하는 16S rRNA gene을 타깃으로 하는 340F와 805R의 primer set을 이용하였고(Nadkarni et al., 2002; Herlemann et al., 2011; Kim et al., 2012), 이를 바탕으 로 디자인한 340F-MID와 fusion 805R의 primer set을 이용하여 PCR을 수행하였다(Table 1). Pyrosequencing 을 위한 polymerase chain reaction (PCR) 방법은 선행 연구를 참조하였다(Kim et al., 2012). 최종적으로 정제 된 DNA는 ASP-2680 (ACTgene)으로 농도를 측정한 후, Macrogen Incorporation (Seoul, South Korea)에 Genome Sequencer 454 FLX Titanium system (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) 분석을 의뢰하였다 (Kim et al., 2012). 분석된 일반 세균 군집의 염기서열 은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) Sequence Read Archive (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)에 등록하여 accession number #SRP090792를 부여 받았다. 분석된 일반 세균의 operational taxonomic units (OTUs)는 3%의 dissimilarity를 기준으로 분류하였으며, 군집의 분류학적 분류는 Mothur program (version 1.33.0)을 이용하였다(Schloss et al., 2009).

HVAC 시스템 중 미생물의 서식이 가장 용이한 증 발기 표면의 세균 생균수를 측정하기 위해(Park and Kim, 2014), 절단한 냉각핀 시료를 전처리하여 얻은 상등액을 이용하였다. 멸균수를 이용하여 연속희석법 으로 시료를 희석하고 희석액을 각 100 μL씩 PTYG 고체 배지에 도말하여 30°C incubator에서 일주일간 배 양하였으며, 그 조성은 Table 2와 같다. PTYG 고체 배 지 위에 생장한 세균의 콜로니를 계수하여 냉각핀 시 료의 중량 (g)당 생균수(colony forming unit, CFU)를 계산하였다(CFU/g-냉각핀). 자동차 HVAC 시스템의 세균을 순수 분리하여 동정하기 위해 모양과 색이 다 른 콜로니를 선별하여 PTYG 고체 배지에 옮겨 재배양 하였다. 화염 멸균한 백금이를 이용하여 재배양한 세균 콜로니를 멸균수 15 μL 넣은 1.5 mL-Eppendorf tube에 옮긴 후, 95°C에서 15분간 열처리하여 세균의 DNA를 추출하였다. DNA 시료를 340F-805R의 primer set (Table 1)를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR products를 agarose gel에 전기영동하여 밴드를 확인한 후, Macrogen Incorporation (Seoul, South Korea)에 염기 서열 분석을 의뢰하였다. 분석된 시료는 NCBI Gen- Bank database에서 nucleotide BLAST를 이용하여 동 정하였다(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

3.결 과

자동차 HVAC 시스템에서 악취를 유발하는 일반 세 균의 군집 구성 비율을 pyrosequencing 분석을 통해 분석하였다. 군집을 구성하고 있는 세균을 속(genus) 수준으로 분석하였으며, 각 속의 구성 비율을 %로 계 산한 후, 이를 log scale로 변환하여 Fig. 2~5에 나타내 었다. Fig. 2은 Actinobacteria 문에 속하는 세균의 구 성 비율을 log scale로 나타낸 것으로, HVAC 시스템을 이루고 있는 전체 군집 중 총 35 속의 세균이 Actinobacter 문(phylum)에 속하였다. Actinobacter 문에서 가장 우점하고 있는 세균은 Rhodococcus로 전체 군집 의 10.780%를 차지하였으며, 그 뒤를 Arthrobacter (0.303%), Blastococcus (0.244%), Leifsonia (0.230%) 순으로 군집을 구성하였다. Fig. 3는 전체 군집 중 Firmicutes 문에 속하는 세균을 나타낸 것으로, 총 30 속 의 세균이 분석되었다. Firmicutes 문에서는 Bacillus이 전체 군집의 0.996%로 가장 높은 비율을 차지하였고, Clostridium이 전체 군집의 0.226%, Sporacetigenium이 0.136%를 차지하였다. Fig. 4은 전체 군집 중 Proteobacteria 문에 속하는 세균의 비율을 log scale로 나타낸 것으로, 가장 많은 58 속의 세균이 Proteobacteria 문에 속하였다. Proteobacteria 문에서 가장 우점하고 있는 세균은 42.426%의 Masilia로 전체 군집에서 가장 높은 비율을 차지하였다. 이어 Sphingomonas (28.200%), Methylobacterium (5.756%), Cupriavidus (1.010%), Phyllobacterium (0.603%), Skermanella (0.265%), Janthinobacterium (0.261%) 순으로 군집을 구성하였다. Fig. 5에는 전체 군집 중, Bacteroidetes, Deinococcus- Thermus, Fusobacteria, Plantomyctes, Gemmatimonadetes 문에 속하는 세균의 구성 비율을 나타내었다. Bacteroidetes 문에는 총 15 속, Deinococcus-Thermus 문에는 2 속, Fusobacteria, Plantomyctes, Gemmatimonadetes 문에는 각각 1 속의 세균이 분석되었다. Bacteroidetes 문에서는 Hymenobacter (3.843%), Chryseobacterium (0.822%), Mucilaginibacter (0.439%), Pedobacter (0.338%), Flavobacterium (0.213%) 순으 로 군집을 구성하였다. 전체적으로 살펴봤을 때. 군집 내에서 가장 우점하고 있는 균주는 Masilia로 전체 세균 군집 중 42.426%를 차지하였다. 그 다음으로는 Sphingomonas (28.200%), Rhodococcus (10.780%), Methylobacterium (5.756%), Hymenobacter (3.843%) 순으로 우점하였다. 위 다섯 종류의 균주가 전체 세균 군집의 90% 이상을 차지하였다.

HVAC 시스템 중 증발기는 다른 부분에 비해 상대 습도가 높고, 유기물이 흡착 되기 쉬운 조건을 지녀 미 생물 생장에 적합한 환경을 지니고 있다(Park and Kim, 2014). 이에 따라 자동차 증발기에서 시료를 채 취하여 증발기에 부착된 세균의 생균수를 측정하고, 순 수 분리 및 동정하였다. 자동차 증발기의 세균의 생균 수를 측정한 결과, 약 3.5×10⁶ CFU/g의 세균이 검출되 었다. 증발기 표면에서 순수 분리한 일반 세균의 동정 결과는 Table 3에 나타내었으며, 총 40 종(species)의 균주가 분리동정 되었다. 문(Pylum) 및 종(species) 수 준으로 살펴보면, Actinobacteria 문에서는 10 종의 일 반 세균(R. Erythropolis, R. fascians, A. phenanthrenivorans, C. flaccumfaciens, G. polyisoprenivorans, J. melonis, M. paraoxydans, M. testaceum, M. luteus, D. nishinomiyaensis)이 분리 동정 되었고, Bacteroidetes 문에서는 2 종(S. linguale, E. tenax), Firmicutes 문에 서는 9 종(B. aryabhattai, B. megaterium, B. simplex, B. subtils, B. thuringiensis, S. epidermidis, S. hominis, S. warneri, Staphylococcus sp.), Proteobacteria 문에서 는 19 종(M. brevitalea, M. suwonensis, S. aquatilis, S. desiccabilis, S. melonis, S. mucosissima, S. panni, S. Phyllosphaerae, S. taxi, M. aquaticum, M. nodulans, M. oryzae, M. foliorum, M. laevaniformans, , P. fluorescens, S. aerolata, B. vesicularis, M. osloensis, R. aquatilis)이 분리 및 동정 되었다.

4.고 찰

HAVC 시스템에서 Massilia는 42.426%로 가장 우점 하고 있으며, 증발기에서는 M. brevitalea와 M. suwonensis, 두 종의 Massilia가 분리동정 되었다(Table 3). Massilia는 1998년에 Massilia timonae라는 종으로 처 음 동정되었다(La Scola et al., 1998). Masilia는 보통 토양, 공기, 물 등의 환경시료나 의료시료에서 분리 및 동정되며, 탄수화물을 이용하여 산을 생성하거나 글루 코스 또는 방향족화합물에 대한 분해능이 있는 것으로 알려져 있다(Zul et al., 2008; Orthová et al., 2015). 특 히나 최근 연구에 따르면, Massilia는 다환 방향족 탄 화수소 또는 유기오염물질을 분해하는 것으로 보고되 었다(Gu et al., 2016). 다환 방향족 탄화수소 또는 유 기오염물질은 자동차 실내환경에 높은 농도로 존재하 여 악취를 유발할 뿐만 아니라 건강 상의 문제를 야기 시켜, 쾌적한 자동차 실내 공기질을 조성하기 위해 관 리해야 할 오염물질로 분류된다(Saksena et al., 2007).

다음으로 시스템 내에 우점하고 있는 Sphingomonas 로 전체 군집의 28.200%를 차지하고 있으며, 증발기에 서는 S. aquatilis, S. desiccabilis, S. melonis, S. mucosissima, S. panni, S. phyllosphaerae, S. taxi 등 총 8 종 의 Sphingomonas가 분리 동정 되었다(Table 3). Sphingomonas는 절대 호기성 균으로 토양, 공기, 먼지 등의 환경시료에서 주로 발견된다(Lee et al., 2001; Rivas et al., 2004; Reddy and Garcia-Pichel, 2007). S. auatilis 는 2001년 천연광천수에서(Lee et al., 2001), S. mucosissima는 2007년 모래의 함량이 높은 사질토에서 (Reddy and Garcia-Pichel, 2007), S. phyllosphaerae는 2004년 콩과나무인 아카시아에서(Rivas et al., 2004) 처음 분리 및 동정 되었다. Sphingomonas는 methyl iodide와 같은 휘발성 할로겐 화합물을 생산하는 대표 적인 세균으로 알려져 있으며(Schulz and Dickschart, 2007), 특히 S. taxi는 hexachlorocyclohexane (HCH)와 같은 유기오염물질을 분해하는 능력을 지는 것이 확인 되었다(Eevers et al., 2015).

Sphingomonas 다음으로 군집을 구성하고 있는 Rhodococcus (10.780%)는 mVOCs를 생산하는 세균으로 잘 알려져 있다(Khoga et al., 2002; Schulz and Dickschart, 2007). 증발기 표면에서 세균을 분리 및 동정한 결과, 이 연구에서는 R. erythropolis와 R. fascians 두 종의 Rhodococcus가 분리동정 되었다(Table 3). R. fascians는 그람 양성균으로 알려져 있으며, dimethyl sulfide (DMS), dimethyl disulfide (DMDS), dimethyl trisulfide (DMTS) 등의 황화계 악취물질을 생산하는 것이 확인 되었다(Khoga et al., 2002; Putnam and Miller, 2008). 이러한 황화계 악취물질은 계란, 양배추 등이 썩는 냄새를 풍기며, 자동차 내 에어컨 시스템에 서 퀴퀴한 냄새를 나게 하는 주범이다(Park and Kim, 2014). 뿐만 아니라 Sphingomonas와 마찬가지로 Rhodococcus 역시 휘발성 할로겐 화합물을 생산하는 대표 적인 세균이다(Schulz and Dickschart, 2007).

전체 세균 군집에서 5.756%를 차지하고 있는 Mehylobacterium은 자동차 HVAC 시스템에서 생물막을 형 성하여 번식하고 악취를 유발하는 VOCs를 생성하는 주요 세균으로 잘 알려져 있다(Rose et al., 2000). 이 연구의 증발기에서 순수 분리동정한 Methylobacterium 은 M. aquaticum, M. foliorum, M. laevaniformans, M. nodulans, M. oryzae로 5 종이다(Table 3). 특히 M. aquaticum은 2014년 자동차 에어컨 송풍구를 이용한 연구에서도 동정된 균으로, 이 연구에 의하면 M. auaticum은 methyl mercaptane, DMS, iso-Valeric acid 등 의 악취 유발 VOCs를 최소감지농도 이상으로 생성하 는 것이 확인되었다(Park and Kim, 2014). 이 외에도 Methylobacterium은 chlorophenol 등의 물질을 생산하 는 것으로 알려졌다(Simmons et al., 1999).

이 밖에도 HVAC 시스템의 군집분석 및 증발기의 세균 동정 결과 Bacillus, Staphylococcus, Arthrobacter, Micrococcus, Pseudomonas 등이 서식하는 것으로 나 타났다. Bacillus와 Staphylococcus는 대사과정 중에 다 양한 VOCs를 방출하는데, 아세트산, 프로피온산, 부티 르산 등의 유기산과 시큼하고 톡 쏘는 냄새의 주범인 암모니아 등의 물질을 방출한다(Schulz and Dickschart, 2007). Arthrobacter와 Micrococcus는 대표적인 악취물질인 황화수소 또는 황화에스테르와 같은 휘발 성 황화합물을 생산하며, Pseudomonas는 휘발성 할로 겐 화합물을 만드는 것으로 알려져 있다(Schulz and Dickschart, 2007).

5.결 론

본 연구에서는 자동차 실내 냄새의 주요 발생원인 HVAC 시스템에 서식하는 세균을 DNA 기반 메타게놈 분석법에 의해 조사한 후 주요 우점 세균의 특성을 냄 새 발생과 제거 측면에서 고찰하였다. 메타게놈 분석 결과 자동차 HVAC 시스템에서 Massilia (42.426%), Sphingomonas (28.200%), Rhodococcus (10.780%), Methylobacterium (5.756%)이 차례로 군집 내에서 우 점하는 것으로 나타났다. 또한 HVAC 시스템 중 미생 물 생장이 적합한 증발기에서는 총 41종의 균주가 순 수 분리동정 되었다. 본 연구의 결과는 향후 자동차 냄 새 원인과 발생 기작을 규명하는데 매우 유용한 정보 를 제공할 뿐 아니라 자동차 HVAC 냄새 제어 기술을 개발하는데 기초 정보로 활용될 수 있다.