1.서 론
표고(Lentinula edodes)는 우리나라를 포함한 동아시 아에서 많이 소비되는 버섯으로 맛과 향이 뛰어나며 영양적인 면에서 우수한 기능성 식품이고 항암 작용과 항비만 효과를 가진 식용버섯이자 약용버섯이다 (Nanba et al., 1987; Lee and Park, 1998; Lee et al., 2014). 표고 재배는 중국에서 기원후 1000년경에 시작 된 것으로 알려져 있다(Lee et al., 2000). 당시의 재배 법은 나무에 상처를 내고 두드리는 충격 재배법 형태 로 노지에서 재배하였다. 우리나라는 조선시대 제주도 를 포함하여 남부 지방에서 주로 표고가 생산되었으며 인공재배는 1922년 임업시험장에서 표고 인공재배시 험을 통해 시작하였다. 그 후, 1955년 표고의 종균 배 양에 성공하였고, 1956년부터는 종균 보급으로 본격적 인 원목 재배가 착수되어 생산량도 증가되었다. 톱밥 재배는 1990년대 초반 일본으로부터 기술이 도입된 후 1993년 재배 기술이 상용화되었고, 연중 생산 기술은 2003년부터 보급되었다. 이러한 재배 기술의 발달은 생산량과 생산액의 증대를 가져왔다.
표고의 생산량과 생산액은 계속적으로 증가하는 추 세를 보여왔다. 건표고와 생표고를 합한 표고의 총 생 산량과 생산액은 2014년에는 1만 999톤과 2,042억원, 2015년에는 2만 4375톤, 2,440억원에 달하였다(Korea Forest Service, 2016b). 수출량은 2014년도 61톤, 137 만 달러, 2015년도 103톤, 208만 달러, 2016년도 175 톤, 298만 달러를 각각 기록하였다(Statistics of Forest Product’s Trade, 2017). 표고버섯을 재배하는 임가의 수 또한 2010년 4,001임가에서 2015년 4,512임가로 500여 임가가 증가하였다(Korea Forest Service, 2016a).
이렇듯 표고의 생산량, 생산액 그리고 재배임가의 수는 꾸준히 늘어가고 있지만 재배하는 시설인 재배사 의 실내환경에 관한 정보는 지금까지 상당히 부족한 실정이다. 특히 톱밥 또는 원목 등의 유기물을 이용해 재배하고 있는 실정에서 상온의 온도와 높은 습도, 그 리고 환기가 표고 재배에 중요한 환경요소인 것을 고 려 할 때 표고 재배사내의 실내공기에는 바이오에어로 졸이 존재 할 가능성이 매우 높다. 0.02-100 μm 크기 를 가진 바이오에어로졸 중 미생물은 바이러스, 세균, 곰팡이 균사, 곰팡이의 포자, 독소 형태로 실내외 대기 환경에 존재한다(Xu et al., 2011). 이러한 바이오에어 로졸 중에서도 부유세균은 전염성 질환을 확산시킬 수 있는 매개체가 될 수 있다(Den Boer et al., 2002). 특 히 전염성 질환이 공기와의 직접적인 접촉을 하는 피 부나 공기를 호흡하는 호흡기와 관련된 경우는 그 전 파력은 매우 크다. 그 밖에도 5 μm 이하 크기의 아주 작은 바이오에어로졸 입자는 폐의 하부 안쪽까지 침입 하여 감염하거나 전염성 질환, 호흡기 질환, 알레르기, 아토피, 암 등을 유발시킬 가능성을 지니고 있다(Psastuszka et al., 2000; Douwes et al., 2003). 그리고 버섯 재배사가 위치하고 있는 유기물이 많은 농가나 축사에 서는 일반 대기보다 세균 농도가 높게 관측이 된다 (Kim and Kim, 2012). 버섯 재배사에 부유세균이 존재 한다면 재배자에게 질병을 유발시키는 것뿐만 아니라 버섯 자체에 식품오염을 일으킬 수도 있다.
최근 Kim et al. (2014)의 조사에서 표고 재배사 실 내에서 인체 유해성이 알려진 세균들이 존재함이 보고 되었다. 그러나 이것은 한 농장에 국한된 초기 조사인 바 다른 지역 재배사에서도 발생하는 일반적인 현상인 지 아직 명확하지 않다. 이에 따라 본 연구에서는 국내 여러 다른 지역의 표고재배사내 실내 부유세균 중에도 인체 유해성을 지닌 균들이 존재하는지 알아보기 위해 서 2년간 11개 지역의 21개 임가의 재배사를 대상으로 부유세균의 농도와 종의 조사를 수행하였다.
2.연구방법
2.1.조사 기간 및 지역
2015년 10월과 11월에 7개 지역(거창, 구미, 부여, 여주, 익산, 장흥, 청양) 소재 10개 표고 재배사와 2016 년 4월-6월에 8개 지역 소재(거제, 구미, 군산, 서천, 여 주, 익산, 장흥, 청양) 11개 표고 재배사의 실내 공기 중 부유세균에 대한 조사와 더불어 온도와 습도를 측 정하였다. 온도와 습도 측정은 각 재배사 내 실내공기 를 3개 지점에서 Testo 410-2 (Testo AG, Germany)를 이용하여 3반복 측정하고 평균값을 구하였다.
2.2.시료 채집 및 세균의 분리 동정
부유세균 채집은 ISO 16000-18에 기반한 충돌법에 따라 측정기기인 Anderson sampler (Single Stage Ambient Viable Sampler, Model 10-880; Tisch Environmental, Cleves, OH, USA)를 사용하여 28.3 L/min 유량으로 1분 간 포집하였다(Andersen, 1958). 부유세 균 채집은 재배사 내 3개 지점에서 진행하였으며, 삼각 대를 이용하여 수평을 맞춘 다음 1.3 m 높이에서 3회 씩 수행하였다. 세균의 배양배지로서는 TSA (Tryptone Soya Agar, Oxoid, UK)에 진균 증식 억제를 위한 항진 균제인 베노밀(benomyl)을 100 ppm 농도로 첨가하여 사용하였다. 실내 공기에서 세균을 채집한 배지는 25°C 배양기에서 3일 동안 정치 배양 후 자라난 세균 군집 수를 계수하여 부유세균 농도를 계산하였다. 배지 에 형성된 세균 군집의 모양과 색, 표면, 가장자리, 불 투명함 정도 등의 형태학적 특징을 관찰하여 서로 다 르게 보이는 세균 군집들을 취하여 새로운 TSA 배지 에 순수 분리하였다.
순수 분리된 세균들은 PCR 기술로 16S rDNA region 염기서열을 증폭한 후 염기서열을 분석하는 분자생물 학적 방법으로 동정하였다. PCR 증폭을 위해서는 순 수 분리된 세균의 군집 하나를 멸균 증류수 100 μL에 풀어 100°C에서 10분간 가열하였다가 얼음에서 5분간 처리하였다. 그 후 13,000 rpm에서 1분간 원심분리를 하여 얻어진 상층액 중 1 μL를 PCR을 위한 주형 DNA로 사용하였다. PCR 반응은 EmeraldAmp PCR Master Mix (Takara, Japan)와 세균 16S rDNA region 특이적인 universal primers 27F와 1492R을 이용하여 T100 Thermal cycler (Bio-Rad, USA)로 수행하였다. 반응 진행은 Pre-denaturation으로 95°C에서 5분간 반 응하고 95°C 1분, 52°C 1분, 72°C 1분 30초 반응을 30 회 반복한 다음 final extension으로 72°C에서 10분간 수행하였다. PCR 증폭된 반응 산물이 16S rDNA인지 확인하기 위해서는 1% 아가로스 겔 전기영동 분석을 수행하고 약 1.4 Kb 크기의 DNA 밴드 존재 유무를 관 찰하였다. 확인된 16S rDNA PCR 반응산물의 염기서 열 분석은 마크로젠사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 진행 하였다. 종 동정을 위해서는 분석된 염기서열을 Ezbiocloud (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon) 데이터베이 스 상에 존재하는 Type species의 16S rDNA 염기서열 과의 상동성 분석을 수행하였다. 계통학적 분석은 MEGA 6.01 프로그램으로 수행하였다(Tamura et al., 2013). 분리된 세균 간의 유연관계 확인을 위한 계통수 작성은 인접연결방법(Saitou and Nei, 1987)을 이용하 였으며, 1,000번의 반복추출(bootstrap resampling) 분 석을 통해 계통수 가지의 신뢰도를 검정하였다.
3.결과 및 고찰
3.1.재배사 내부의 온도와 습도
2015년과 2016년 두 해에 걸쳐 표고버섯 재배사 내 온도와 습도를 측정한 결과 온도의 경우에는 2015년 장흥의 원목 재배사에서 16.2°C로 가장 낮게 측정되었 다. 반면 최고 온도는 2016년 구미의 원목 재배사에서 30.8°C로 가장 높게 측정되었다(Table 1). 습도의 경우 에는 2016년 구미의 원목 재배사가 28.2%로 가장 낮 은 습도를 기록하였고, 2016년 여주의 톱밥 재배사가 85.6%로 가장 높은 습도를 기록하였다. 전체 재배사의 온도 범위는 16.2°C에서 30.8°C 사이였고, 습도는 28.2%에서 85.6% 사이로 관측되었다. 표고 재배사는 버섯 생육과 발생을 위해 주기적으로 살수를 하고 있 어 재배사 내의 습도는 전반적으로 높은 수치를 갖는 환경임을 알 수 있었다. 이러한 결과는 표고 재배사 내 에서 세균이 자랄 수 있는 조건을 충족하는 환경임을 나타낸다.
3.2.재배사내 부유세균의 농도
지역별로 채집한 시료를 25°C 배양기에서 3일간 배 양한 자라난 부유세균의 군집들을 계수하여 농도를 측 정하였다(Table 1). 부유세균 농도는 1.0 × 102 cfu/m3에 서 1.0 × 104 cfu/m3 수준의 농도를 보였다. 톱밥배지이 용 재배사 중에서 세균농도가 가장 높게 나온 지역은 2015년 부여의 재배사로서 1.05 × 104 cfu/m3를 기록하 였다. 반면에 농도가 가장 낮게 나온 지역은 1.24 × 102 cfu/m3를 기록한 2016년 청양의 재배사이었다. 그리고 원목이용 재배사 중에서 농도가 가장 높았던 지역은 2016년 서천의 재배사이었으며, 그 값은 6.24 × 103 cfu/m3로 측정이 되었다. 반면 가장 낮은 농도는 2016 년 장흥의 재배사로 2.06 × 102 cfu/m3이었다. 이는 재 배사 관리에 따라 세균 농도에 차이가 나는 것으로 보 여지며, 원목 또는 톱밥배지라는 재배방식에 차이는 아 닌 것으로 보여진다. 세균농도를 부유세균 관리 수준의 농도인 환경부의 다중이용시설등의 실내공기질 오염물 질 유지 기준치인 800 cfu/m3에 견주어 보았을 때 21 개 재배사 중 15개 재배사에서 기준치를 초과하였다. 이런 결과는 표고 재배사내 온도와 습도가 세균이 잘 성장하는 환경이기에 세균 농도가 높게 나온 것으로 사료된다. 온도와 습도를 조절하는 시설을 갖춘 청양의 톱밥배지이용 재배사의 경우 세균농도가 낮게 나온 결 과는 눈 여겨 볼 의미가 있다.
3.3.분리된 부유 세균의 동정
2년간 21개 표고버섯 재배사 내 공기에서 33속 76종 의 부유세균을 분리하였다. Bacilli 그룹이 33종으로 가 장 많이 분리되었으며 그 다음으로 Actinobacteria가 23종이 분리되었다(Fig. 1, Table 2). 그리고 α-proteobacteria와 β-proteobacteria는 각각 2종이 분리되었으며, γ-proteobacteria는 12종이 분리되었다. Flavobacteria와 Sphingobacteria도 각각 2종이 분리되었다. 흥미롭게도 76종 중 31종은 다른 재배사에도 공통으로 분리가 되 었다. Bacillus 그룹은 그람양성의 막대형 세균으로 토 양을 비롯한 자연계가 널리 분포하는데 두터운 세포벽 을 가지고 있어서 환경스트레스에 견디는 특성을 지닌 그룹으로 알려져 있다. 이러한 특성에 따라 본 조사에 서도 버섯재배사 공기 중에 우점 세균 그룹으로 나타 난 것으로 사료된다. 속 수준에서는 바실러스속(Bacillus) 과 포도상구균속(Staphyloccous)에 속하는 세균이 우점을 차지하였다. 흥미롭게도 23종의 Actinobacteria 가 분리되었는데 이 분류군 또한 그람양성균으로 Streptomyces 속이 우점하였다. Streptomyces 균은 균사 형으로 자라면서 포자를 형성하는 세균으로 2차 대사 물질로서 항생물질을 생산하는 그룹이다(Kieser et al, 2000). 방선균인 Streptomyces sindenensis는 actinomycin D를 생산하는 종으로 알려져 있다(Tripathi et al., 2012). 일반적으로 방선균은 토양에 주로 서식하 는 균으로서 배양 시 토양 냄새를 내는 특성을 가지고 있다.
3.4.동정된 부유 세균의 보고된 인체 위해성
10개 지역 11개 재배사의 21개 공기 시료에서 분리 된 33속 76종 세균에 대한 인체 위해성을 조사한 결과 조사 지역의 2/3에 해당하는 14개 재배사(2015년 거창 원목 재배사, 2015년 구미 원목 재배사, 2016년 구미 원목 재배사, 2016년 군산 톱밥배지 재배사, 2015년 부여 톱밥배지 재배사, 2016년 서천 원목 재배사, 2015년 여주 farm A 톱밥배지 재배사, 2015년 여주 farm B 원목 재배사, 2016년 여주 farm B 원목 재배사, 2015년 장흥 톱밥 재배사, 2016년 장흥 톱밥 재배사, 2015년 장흥 원목 재배사, 2016년 장흥 원목 재배사, 2015년 청양 톱밥 재배사) 등에서 10속 15종의 인체 위해성을 지니는 것으로 보고된 세균이 존재하였다 (Table 2). Acidovoraz oryzae는 카테터 관련 혈류감염 을 일으키는 것으로 보고되어 있고(Orsborne et al., 2014), Bacillus infantis는 신생아에게 패혈증(Neonatal sepsis)를 유발하는 것으로 보고되어 있으며(Ko et al., 2006), Bacillus licheniformis 는 균혈증(bacteremia)과 척추염(Spondylitis)를 일으키는 것으로 보고되어 있다 (Kim et al., 2012). 그리고 Cellulosimicrobium funkei는 생물안전 등급2에 해당하는 균으로 균혈증(bacteremia) 를 일으킬 수 있으며(Petkar et al., 2011), Ewingella americana는 패혈증(Sepsis)를 일으킬 수 있는 것으로 보고되어 있다(Devreese et al., 1992). Exiguobacterium sibiricum 은 피부 감염을 일으킬 수 있는 균으로 피부 탄저병과 닮은 병반을 일으키는 것으로 보고되어 있다(Tena et al., 2014). Leclercia adecarboxylata는 복 막염(Peritonitis)을 일으키는 것으로 보고되어 있고, 총 4개 재배사에서 분리가 되었다(Fattal and Deville, 2000). Lysinibacillus fusiformis와 L. sphaericus는 균혈 증(bacteremia)과 패혈증(Sepsis)를 일으키는 것으로 보 고되었으며 각각 3개 재배사와 4개 재배사에서 분리되 어진 만큼 감염에 주위가 필요한 것으로 여겨진다 (Wenzler et al., 2015). 그리고 Pseudomonas fulva는 급성 뇌수막염(acute meningitis)과 균혈증(bacteremia) 을 일으키는 것으로 알려져 있으며(Almuzara et al., 2010; Seok et al., 2010), Raoultella terrigena와 Staphylococcus cohnii는 둘 다 생물안전 등급2에 해당하 는 균으로 패혈증(Sepsis, Septicemia)을 유발하는 것으 로 보고되어 있다(Shaikh and Morgan, 2011; Garza- González et al., 2011). 특히 S. cohnii의 경우 인체 피 부에서 흔히 발견이 되며, 이번 연구에서도 6개 임가에 서 분리가 된 만큼 감염에 유의할 필요가 있는 것으로 사료된다. 그리고 S. haemolyticus 또한 생물안전 등급 2에 해당하는 균으로 심내막염(endocarditis)과 혈류감 염(bloodstream infection)을 일으키는 것으로 보고되어 있으며(Veach et al., 1990; Flcone et al., 2007), S. saprophyticus는 단순 비뇨기 감염 질환을 유발한다 (Kuroda et al., 2005). 그리고 S. sciuri는 심내막염 (endocarditis)을 유발한다고 보고되어 있다(Hedin and Widerström, 1998). 이러한 결과는 표고 재배사 내 공 기 중에는 인체 위해성이 보고된 10속 15종의 다양한 세균들이 부유하고 있음을 나타내었다.
4.결 론
국내에서 지금까지 버섯 재배사의 실내환경은 버섯 생산적 측면에서만 고려되어 왔다. 이에 따라 생산에 참여하는 작업자에 대한 인체위해성에 대해서는 알려 진 바가 적다. 다만 버섯이 분류학적으로 진균인바 버 섯이 만들어 발생시키는 포자가 재배사 실내에서 작업 하는 작업자에게 알레르기를 유발시킨 사례는 종종 있 어 왔다. 본 조사 연구에서 버섯 재배사 실내공기 중 부유세균의 농도가 국내 환경부 실내공기질 유지 기준 치를 넘는 수준으로 존재하는 곳이 있음을 확인하였다. 또한 부유하는 세균 중에 인체에 유해한 종이 부유 한 다는 정보를 얻을 수 있었다. 세균이 부유한다고 모두 해를 줄 수 있는 것은 아니지만 특정한 오염원으로부 터 지속적으로 고농도로 부유할 경우는 인체에 건강 영향을 줄 수 있는 바 버섯 재배사의 실내 공기에 대한 관리가 필요하다고 사료된다. Kwon et al. (2016)은 표 고 재배사 내에 존재하는 검정날개버섯파리로부터 인 체 위해성이 보고된 세균들을 분리하여 보고하였다. 이 러한 위생 해충은 세균들을 매개할 수 있기 때문에 재 배사 실내환경의 위생과 관련하여 향 후 추가적으로 유해 세균의 출처를 파악하고 이를 예방할 수 있는 예 방법에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
