1. 서 론

 환경오염과 그 영향에 따른 피해에 대한 관심이 높은 가운데 많은 기관과 연구자들은 환경항목에 대한 측정을 수행해왔다. 다양한 환경오염 물질 중에서 미생물 항목은 다른 물리적, 화학적 측정 항목과 달리 살아있는 생물체를 대상으로 한다는 점과, 개별적으로 존재하기보다는 군집(cluster)으로 존재하고 수분과 같은 필수매개체를 생존에 요구한다는 점이 특징이다(Chang et al., 1994). 이와 같은 특징은 환경에서의 미생물 항목 측정의 근본적인 어려움으로 인식된다. 물이나 토양과 같은 매질에 비해 공기 중의 미생물은 안정적인 상태를 유지하지 않고 시간적, 공간적 변화의 폭이 크다. 이는 매질(medium)의 특성 상 자생적(autochthonous)이기보다 토양 등의 외부로부터 기원한 미생물이 대부분을 차지하고(allochthonous) 혼합의 정도가 활발하기 때문이다(Cruz and Buttner, 2007).

한편 공기의 혼합이 비교적 활발한 외부와 달리 실내환경에서는 오염물질로서 미생물에 대한 우려가 상대적으로 더 큰 것이 현실이다. 특히 최근 들어 실내에서 생활하는 시간비중이 늘어남에 따라 밀폐된 실내공간에서의 미생물 오염도 측정은 주된 관심사가 되고 있다. 실내환경에서 미생물은 바이오에어로졸로도 불리는데, 부유성으로서 실내 공기의 유동이 적을 경우 바닥으로 침강하여 측정 위치와 시간에 따른 편차가 크다. 일반적으로 사용되는 미생물의 측정은 일정량의 공기를 흡입하여 사전에 준비된 배지에 충돌시킨 후, 배지에 고정된 미생물을 일정 시간 배양하여 생성된 콜로니의 수를 계수하는 방법을 사용한다(Grinshpun et al.,2007). 이 방법은 살아있는 미생물의 수를 측정함으로써 인체 등에 대한 영향을 평가할 수 있는 장점이 있다. 그러나 한편으로는 배지의 성분과 배양조건에 따라 실제 살아있는 미생물을 한꺼번에 모두 측정할 수 없다는 한계도 갖고 있다. 이와 같은 근본적인 오차(accidental error) 이외에도 측정기기 자체에서 기원하거나 측정자가 달라짐에 따라 발생하는 오차(systematicerror)와 반복측정 수가 적음에 따라 나타나는 오차(random error)는 부유미생물의 측정과 평가시에 반드시 고려해야 할 사항이다(Macher, 1989).

 미생물의 측정에 있어서 필요한 정도관리 (quality control)와 정도보증(quality assurance)은 매질이 물인 경우에는 상대적으로 체계적인 논의가 진행되어 왔다(USEPA, 1978; USGS, 1989; 국립환경연구원, 2004). 반면 공기 중 미생물에 대한 자료의 질적 관리 실태는 매우 부족한 실정이다(Xua et al., 2011). 이에 따라 본 연구에서는 수질에서 시행되고 있는 방법을 준용하여 실내환경에서의 미생물 측정과 정도관리에 대한 절차를 통계적 방법에 기초하여 제시하고자 하였다.

2. 연구방법

통계적 분석을 위한 미생물학적 계수결과 자료는 시간과 측정방법에 따른 오차를 최소화하기 위해 단기간에 걸쳐 동일한 방법과 기구를 김명운 163 Journal of Korean Society for Indoor Environment Vol. 9, No. 2 사용하여 수집한 결과를 이용하였다. 2007년 10월 1일부터 31일까지의 기간 동안, 오전 10시 ~ 오후 4시의 시간대에 시료 채취가 이루어졌으며, 대상 실내공간은 서울시내 지하철 역사 20곳으로서 전체적인 방법은 실내공기질 공정시험 기준 가운데 총부유세균 시험방법 - 충돌법을 따랐으며, 한 장소에서 동시에 3개의 시료채취기(Anderson's single stage impactor; Tisch Environmental Inc, USA)를 가동하여 3회 반복채취하였다. 공기의 흡입을 위한 펌프는 28.3L/min의 일정한 유량으로 가동하였으며, 사전에 3대의 펌프에 대한 보정을 통해 유입유량의 차이에 따른 오차를 제거하였다. 사용한 배지는 R2A agar (Becton, Dickson and Company, Sparks USA)로 제조사의 지시에 따라 제조하였다. 동일한 시기에 제조한 배지 가운데 10%에 해당하는 평판배지는 배양시 채취된 시료와 함께 배양하여 바탕시료(negative control)로서 오염도를 확인하는 데에 이용하였다. 부유세균이 수집된 미생물 배지는 즉시 실험실로 운반하여 35^oC ± 1 의 배양기에 배양하였다. 배양 후, 24, 48, 72시간 간격으로 형성된 콜로니의 수를 계수하여 시간 변화에 따른 콜로니수의 증가를 기록하였다. 한편 측정과 분석을 실시하는 시험자 사이의 오차를 확인하기 위하여 동일한 시료에 대한 시험을 수행하고 결과를 비교하는 숙련도검사(proficiency test)를 실시하였다. 

시료채취 시에 온도와 습도를 동시에 측정하였으며 지점별, 배양시간별로 계수된 결과를 통계자료로서 분석하였다. 통계분석은 SPSSv14(IBM, USA)를 이용하였고, 분석정밀도(analyst precision) 검사와 통계적 신뢰도에 대한 기준은USEPA(1978)와NELAC(National Environmental Laboratory Accreditation Program)에 제시된 수질에서의 미생물 정도관리 절차를 따랐다(NELAC, 2002). 

3. 결과 및 고찰

환경시료의 분석에 있어서 발생할 수 있는 오차 가운데 계통오차(systematic error)는 분석기기의 정밀도 향상과 숙련도 검사를 통하여 보정할 수 있다. 본 연구에서는 분석기기에 대해 흡입펌프와 시료채취기의 동일성 검증을 통하여 사전에 계통오차를 제거하였다. 시료채취에 사용된 장비는 동일 회사의 동일한 라인에서 동시에 생산된 것으로서 검사를 통하여 일정한 유량(±0.01 L/min)과 충돌효과를 지니고 있는 것으로 판정되었다. 또한 매 측정시마다 유량보정을 실시하여 표시된 유량에 따라 일정하게 흡입하고 있음을 확인하였다. 

계통오차로서 두 번째 원인으로 지적되는 시험자 사이의 오차에 대해서는 숙련도 검사를 통하여 분석결과에 미치는 영향을 판단하였다. 숙련도 검사절차는 다음과 같다. 미생물학에 관한 지식을 습득하고 실험실에서의 분석에 숙달 되었다고 판단되는 시험자를 선정한 후 시험과정 전체에 대한 교육을 실시하였다. 사전 모의시험을 거쳐 최종적으로 6인을 선정하여 숙련도 검사를 실시하였다. 시험용 시료는 동일농도의 공기 중 미생물 시료 제작의 어려움 때문에 물 시료로 대신하였다. 일정 농도의 미생물이 존재하는 물 시료에 대하여 10⁰ ~10^-2 의 희석과 평판배지에의 접종을 거쳐 48시간 동안 배양된 배지 가운데 300 CFU 미만을 보이는 희석배수를 선정하여 각 시험자(A~F)에게 콜로니를 계수하도록 하였다. 계수는 각자가 평상시 사용하는 절차와 방법을 따르도록 한 후, 다른 사람의 계수결과를 알지 못하는 상태에서 보고된 결과(blind test)를 종합하였다(Wibby, 2004). 이러한 숙련도 시험은 미생물학적 배양과 계수 각 과정에 대한 시험자 사이의 균질성 여부를 확인하기 위한 것으로서, 공기 중의 미생물을 대상으로 하는 본 연구의 경우에는 사전 제작된 배지의 시료채취기에의 장착 및 탈착, 시료채취기의 가동, 계수(count) 가운데 가장 중요하다고 판단되는 계수에 중점을 둔 것이다.

6인의 시험자별로 5개의 반복시료에 대한 기하평균(geometric mean)은 14 ~ 23 CFU (전체 기하평균 19 CFU)로서 전체 기하평균의 59 ~ 97% 범위 내에 존재하였다. 시험자별 기하평균에 대한 표준편차의 비율은 0.18 ~ 0.46으로 비교적 균일하였다(Table 1). 

Table 1. Summary of proficiency test result for the microbiological experiment^*.

반복시료에 대한 평가 기준으로서 산술평균(arithmetic mean)이 아닌 기하평균을 사용하는 이유는 미생물의 생장이 지수적으로 이루어짐에 따라 이를 반영하는 것이 합리적이고, 표본에서의 편차를 최소화하는 방법이기 때문으로(Robertson, 1931) 계수된 결과를 로그변환한 후의 산술평균을 구함으로써 일반적으로 수행되어 오고 있다. 한편, USEPA에서 제시하는 물시료의 미생물 평판계수 시 숙련도 평가의 기준은 동일 시료에 대한 분석자 간의 차이가 10%를 넘지 않아야 한다고 규정하고 있다(National Association of Testing Authorities, 2004). 그러나 이 기준은 대장균과 같이 단일한종으로 이루어진 표준시료에 대한 기준으로서, 총부유세균과 같은 일반세균 혼합군집을 대상으로 하는 경우나, 표준시료가 아닌 환경시료인 실내 공기를 대상으로 하는 경우에는 지나치게 엄격하므로 공기 중 미생물 측정에 대한 연구 결과를 종합한 별도의 기준이 필요하다고 할 수 있다. 

우연오차(random error)의 발생은 미생물 시료 자체의 불균질성을 근본원인으로 하고 있어 완전한 제거에는 한계가 있으나 시료의 반복수(replicate number)를 증가함으로써 최소화시킬 수 있다(Berthouex and Brown, 2002). 그러나 미생물 시료의 반복수 증가는 많은 비용과 시간을 요구하므로 일상적으로 이루어지는 측정에는 적용하기 어렵다. 다만 1개 시료의 측정만으로는 편차에 대해 판단한다는 것이 불가능하기 때문에 최소한 3개의 반복수가 필요하다. 3개의 시료 결과를 상호비교 함으로써 편차가 큰 이상치(biased data)를 자료의 분석에서 제외시킬수 있기 때문이다.

본 연구에서는 동일 장소에서의 분석시료를 3대의 시료채취기를 사용하고, 3회 반복채취함으로써 통계적 우연오차를 최소화시키기 위한 자료를 마련하였다. 한편 동일한 평판배지에서 자란 미생물의 콜로니 수를 24, 48, 72시간 간격마다 계수한 결과는 각각의 범주로 구분하여 독립적으로 분석하였다. Table 2에는 기본적인 기술통계량이 나타나 있다. 

Table 2. Basic statistical parameters of colony forming units (CFU) and Log-transformed CFUs (Log(CFU)) counted after incubation time of 24, 48, and 72 hours.

단순계수된 콜로니수(CFU)의 평균(산술평균)은 24, 48, 72시간 배양한 이후의 값이 각각 4, 54, 131 CFUs/plate로 측정되었다. 한편, 로그변환된 콜로니수(Log(CFU))의 평균값을 기하평균에 해당하는 변환 이전값으로 환원하면 각각 3(=10^0.486), 36 (=10^1.557), 83 (=10 ^1.921) CFU/plate로 나타나 산술평균에 비해 전반적으로 낮은 것으로 나타났다. 산술평균과 기하평균 가운데 어떤 값이 보다 대표값에 가까운가에 대한 평가는 표준편차의 평균에 대한 비율(STD/Mean)으로서 가능하다. 기하평균의 경우, 미생물의 배양시간이 길어질수록 변동비율은 감소하는 경향을 잘 보여주고 있으며 상대적으로 산술평균에 비해 변동폭이 적은 것으로 나타나 대표값으로서 기하평균(로그변환된 산술평균)의 의미를 강조하고 있다. 

그러나 대표값으로서 기하평균과 산술평균 가운데 어떤 것이 의미를 갖는가에 대한 판단 이전에 시간에 따른 콜로니수에 대한 평가에 우선 주목해야 한다. 본 결과에서는 24시간 배양한 이후의 콜로니수가 기하평균으로 3 CFU(범위 21 CFU)에 불과해 매우 낮게 나타났으며, 48시간 배양한 경우에도 기하평균 36 CFU (범위 165 CFU)로 비교적 낮았다. 그러나 평판배지에서의 콜로니 계수 시의 오차를 최소화할 수 있는 유효범위 30~300의 범위에 해당하므로 통계적인 의미는 갖고 있다고 할 수 있을 것이다(APHA, 2005). 배양시간을 충분히 늘린 결과인 72시간 배양 후의 결과는 기하평균 83 CFU로서 평판 당 30~300의 범위에는 해당하지만 일부 시료(118개 평판 가운데 8개, 6.8%)에서 300 CFU 이상의 값을 보였다.

시간에 따른 차이가 커진 이유로서는 시험 현장의 부유미생물 농도가 비교적 낮았기 때문이기도 하지만, 시험에 사용한 배지의 영향일 가능성도 존재한다. 본 연구에 사용한 R2A 배지는 미생물 회수(recovery)에 우월한 특성을 지니고 있어 선정하였다. 즉, 일반적으로 사용되는 TSA나 NA 배지는 유기물 농도가 지나치게 높아 실제 환경에서 미생물이 생존하는 조건과 달라 정확한 측정에 한계가 있다는 점이 알려져 있어 그 대안으로 물 이외에도 공기, 토양 등에 있어서 널리 사용되는 미생물 검출용 배지이다(Griffin, 2007). 단일 또는 입자에 부착되어 존재하는 미생물을 배양을 통해 계수하는 원리로서 농후배양(enrichment culture)은 낮은 유기물 농도에 존재하는 미생물에게 스트레스로 작용할 수 있으므로, 물보다 영양조건이 불리한 공기 중의 미생물 계수에 있어서 배지에 대한 적절한 선정은 중요한 고려사항이 될 수 있기 때문이다. 

공기 중에 존재하는 미생물이 배지에 포집되었음에도 불구하고 미생물의 종류와 상태에 따라 가시적인 콜로니를 형성하는 데에는 서로 다른 시간이 요구된다. 그러나 배지의 조건이 생존하는 미생물에 모두 적합하지 않기 때문에 시험에 있어서 적절한 배지와 충분한 배양시간에 대한 고려가 있어야 할 것으로 사료된다. 

한편, 실내공기질 유지기준으로서 의료기관 등에 적용되는 부유미생물 농도인 800 CFU/m³를 공기채취량의 최소기준인 250 L (=0.25m³ )에 비교하면 유지기준에 적합한 농도는 200 CFU/plate 미만이 되어야 한다. 즉, 250 L의 공기를 충돌법에 의해 채취하였을 때 48시간 배양 후 콜로니 수가 200 CFU를 초과할 수 없다는 의미이다. 또한, 부유미생물의 농도가 기준의 15% 미만 (120 CFU/m³ )일 경우에는 평판에서의 콜로니 수가 30 미만이 되어 통계적 유효성이 사라지는 문제를 갖고 있다. 그러므로 실제 시험에 있어서 통계적인 고려와 이에 따른 정확한 유지기준 판정의 범위는 매우 좁다고 할 수 있다. 

물 시료에서의 오염도를 평가하는 지표인 대장균군(coliforms)의 계수에 있어서는 24시간 배양으로 판정이 어려울 경우, 추가로 24시간을 배양하여 48시간 결과로서 판정하거나, 배지에서의 미생물 수가 지나치게 많거나 군집을 이루어 계수의 정확성이 떨어질 경우 이를 무효로 판정하여 재시험하도록 하고 있다. 이와 같이 콜로니의 계수에 있어서 정확성을 평가하기 위한 배양시간 및 평가방법에 대한 기준이 공기 중의 미생물에 있어서도 마련되어야 할 것이다. 

Fig. 1에는 Table 2의 각 자료에 대한 분포도를 비교하였다. 유사군집으로부터 얻어진 자료는 자료의 개수가 증가할수록 정규분포에 근접하는 경향을 보이며, 정규성에 대한 지표 가운데 왜도(skeness)와 첨도(kurtosis)를 비교할 수 있다. 왜도는 대칭형의 표준정규분포가 0의 값을 보이고, -3일 경우 왼쪽으로 치우친 형태, 3일 경우 오른쪽으로 치우친 형태를 나타내는 값이다. 첨도는 표준정규분포의 값이 3이며, 2보다 작을 경우 짧은 꼬리형, 8보다 클 경우 긴꼬리형을 보이는 것으로 알려져 있다. Table 2에 나타난 왜도와 첨도 값은 역시 로그변환된 자료가 보다 기본적인 정규분포형에 가까움을 보여주고 있다. 다만, 각 분포도에 표시된 평균값의 경우에는 정규분포의 중앙에 분포하기 보다는 한쪽으로 치우치는 양상을 보여주고 있는데, 이는 시료 가운데 지나치게 낮거나 높은 콜로니 수의 집중에 따른 현상이라고 볼 수 있다. 

Fig. 1. Frequency distribution for the colony forming unit (CFU; (a)~(c)) and log-transformed CFU (Log(CFU); (d)~(f)) with the difference of incubation time after 24, 48, and 72hours. Dotted bar represents mean value of each category.

통상적으로 물에서의 미생물 수를 평판계수법에 의해 계수할 경우에는 평판(plate)당 30~300개의 콜로니 범주에 속하는 것만을 계수하기 위해 희석(dilution)의 방법을 사용하고 동일 시료에 대한 3가지 이상의 희석수(dilution fold)를 둠으로써 적절한 범위의 평판만을 골라 계수하도록 할 수 있다(예, 10^-1, 10^-2, 10^-3의 희석결과 얻어진 콜로니수가 각각 5, 55, 450 CFU/plate로 나타났을 경우, 30~300의 범위에 해당하는 10^-2의 희석결과인 55만으로 계수한 후, ×10²으로 미생물의 농도를 환산). 반면에 실내환경에서의 미생물 시료에 대한 계수의 경우에는 희석이 제한적일 수 밖에 없고 사전에 대상 미생물의 분포에 대한 지식을 얻기 어려우므로 이같은 기준을 적용하기 어렵다. 

실내환경에서의 미생물 측정 표준방법인 충돌법에 의한 시료채취기를 사용할 경우 펌프의 가동시간을 다르게 함으로써 통계적으로 의미 있는 범위의 평판을 선별하는 방안이 있을 수 있다. 그러나, 존재하는 미생물의 농도가 낮을 경우에는 가동시간을 길게 하여야 하는데 흡입 공기의 양이 증가할 경우 공기 중의 수분이 배지에 응결되어 콜로니의 분포가 고르지 않게 되는 결과가 초래된다. 반면에 미생물의 농도가 높을 경우에는 별도로 깨끗한 공기를 혼합시켜 흡입시키는 별도의 장치가 필요하다. 이같은 방법상의 한계로 인해 통계적으로 적절한 범위에 있는 미생물의 수를 얻기 위한 시료채취기의 개선이 필요한 실정이다. 현재까지는 이같은 통계적 의미성에 대한 심층적이고 다양한 연구의 결과가 미흡하므로 정확한 실내공기에서의 미생물 농도를 측정하기 위한 판단은 어려운 것이 현실이다. 따라서 본 연구결과에서와 같이 시료채취의 반복수를 늘리고 기하평균에 의한 대표값을 산출하여 비교하는 것이 최소한의 방안이라고 할 수 있다. 

미생물 분석에 있어서의 편차에 대한 분석정밀도 기준으로는 물 시료에 대해 NELAC에서는 다음과 같은 방법을 제시하고 있다(NELAC, 2002). 표준시료에 대해 반복수(replicate)를 두어 시험하고 결과를 계수한다. 계수 결과를 로그 변환하고, 동일하게 시험된 각 반복에 대한 범위(R, range)를 얻는다. 해당 실험실에서 일정기간 동안 얻어진 범위의 산술평균()을 기준으로 한다. 일상적인 분석시료의 10%를 반복하여 분석한 결과가 3.27의 구간에 위치한다면 99%의 유의수준에서 기준정밀도를 만족시키는 것으로 판단한다. 이 기준은 물리화학적 분석항목에 비해 매우 넓은 분석정밀도 기준으로서 미생물 시료의 불균질성이라는 특징을 잘 보여주는 사례이다. 본 연구에서는 전체적으로 얻어진 는 0.67, 3.27는 2.19로 계산되었으며, 이에 따라 기준정밀도 만족여부를 판단하였다.

우리나라의 실내공기질 공정시험기준은 2004년 6월 5일 최초 제정되어 고시된 후, 2008년과 2010년 개정되었다. 현행 공정시험기준에서 미생물 항목인 총부유세균의 정도관리와 관련된 사항으로는 공기채취량 250L 이상, 시료채취 간격 20분 이상으로 3회 연속채취, 현장바탕시료(negative control)의 사용, 시료채취장비의 구멍(positive hole) 수에 따른 보정 등의 규정을 두고 있다. 그러나 공기 중의 미생물 분석에 대한 정도관리는 배지의 선정, 시료채취와 배양시간의 적절성 평가, 계수결과에 대한 정리 등 보다 다양한 측면에서 추가적으로 검토되어야 할 것이다. 

본 연구의 결과를 통해 계수 결과의 정리에 있어서 단순한 콜로니의 계수에서 벗어나 자료의 정리에 있어서 시간경과에 따른 영향을 고려하여 48시간 보다 긴 시간의 배양이 보다 정확한 결과를 나타낼 수 있다는 점과 산술평균 보다는 기하평균으로서 대표값을 나타내야 하며, 표준편차와 같은 통계적 자료도 함께 제시해야 함을 강조할 수 있다. 

이상과 같은 통계적 판단과 함께 측정된 20개 지하철 역사에서의 공기 중 미생물 농도를 계산하였다(Fig. 2). 배양시간 24, 48, 72시간의 시료군 가운데 공정시험법에 의한 기준시간인 48시간을 배양한 후 계수한 결과는 로그변환된 반복시료의 범위(R)는 0.11~1.74로 나타나 정밀도 기준을 만족하는 것으로 판정하였다. 

Fig. 2. Bacterial concentrations of 20 subway stations (arbitrarily assigned) by the plate count result after 48hr incubation. Circle and bar represents average value and 95% confidence interval for

Fig. 2에 나타난 바와 같이 전체 20개 지하철 역사의 미생물 농도는 평균 147 CFU/m³ 으로 측정되었다. 가장 적은 농도는 36 CFU//m³의 5호선 가운데 한 역사였으며, 가장 높은 농도는 252 CFU//m³의 8호선 가운데 한 역사였다. 우리나라의 실내공기질 유지기준에 따르면 다중이용시설 가운데 지하역사 등에는 총부유세균의 기준이 없으나 의료기관 등에 적용되는 800 CFU//m³을 참고로 한다면 모든 대상 지하철 역사에서 기준을 만족하는 것으로 평가할 수 있다. 한편, 이값은 Kim et al.(2002)이 측정한 평균 504 CFU//m³이나 Sohn et al.(2006)의 평균 1,856 CFU//m³에 비해서도 낮은 값이나, 자료의 정밀도와 신뢰도에 대한 평가 등이 이루어지지 않은 결과와의 단순비교에는 한계가 있다는 점과 본 측정결과가 특정 시기에 1회성으로 이루어진 점을 고려하면 지하철 역사별 오염도에 대한 자료보다는 정도관리와 정밀도 평가를 통한 결과 산출의 측면에만 의미를 두어야 할 것으로 판단된다. 본 분석결과는 유사한 환경에서 측정한 시료의 갯수를 증가시킴으로써 통계적 평가를 위한 자료를 축적하고 이를 통한 바람직한 정도관리의 방향을 제시하기 위한 것으로서 배지의 선정, 동일 장소에서 모집단이 통일된 조건에서의 분포에 대한 통계적 검증, 시료채취기의 개선 등의 연구가 뒤따라야 할 것으로 사료된다.

4. 결 론

 실내환경에서의 미생물 측정 과정에서 나타나는 오차를 고려하기 위해 서울시내 20개 지하철 역사에서 분석한 시료를 대상으로 수질에서 통용되는 기준과 통계적 방법을 사용한 평가를 실시하였다. 분석기기와 시험자의 숙련도에 따른 계통오차를 최소화하기 위한 방법으로 사전에 기기의 동일성 검증과 숙련도 검사를 수행하였다. 또한 시료의 반복수 증가를 통한 우연오차의 제거와 반복시료에 대한 기하평균을 산출함에 따른 정도관리의 방안을 제시하고자 하였다. 공기 중 부유미생물에 대한 정확한 측정과 평가를 위해서는 배지에 대한 고려, 배양시간에 따른 계수결과의 반영, 반복 시료에 대한 기하평균의 사용 및 보조통계자료의 제시등을 포함한 종합적인 정도관리가 필요할 것으로 판단되었다.