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1. 서론

 현대인들은 실내공간에서의 생활시간이 길어짐에 따라 공간 내 실내공기가 인체에 미치는 영향에 대한 관심이 집중되고 있으며, 쾌적한 실내환경을 조절하는 에어컨, 공기청정기 등이 많이 등장하였다. 그러나 공기 중 부유 곰팡이가 에어컨 혹은 공기 청정기 내부에서 서식, 번식함으로써 재실자의 인체에 악영향을 미칠 수 있다(Burge, 2001; Stark et al., 2005). 또한 음식물, 이불, 옷 등과 같은 유기성 재료들의 취급에 의해서 곰팡이의 확산이 촉진된다(Lehtonen et al., 1993).

 곰팡이 입자의 구성은 크게 포자(spore)와 파편(fragment)으로 나뉘며, 그 중 생물학적 성장 및 번식과 관여되는 입자는 포자이다. 이러한 곰팡이 포자는 알레르기성 비염 등과 같은 호흡기 질환을 유발한다(Portnoy et al., 2005; Holme et al., 2010). 포자는 공기 중에 부유해서 이동하거나 중력에 의해 침전되어 호흡계에 도달하게 된다(Reponen et al., 1994). 입자의 크기가 10㎛이상의 포자는 호흡기계의 상부 위치인 후두(larynx)나 인두(pharynx)에 침착되어 고열증세를 유발하고, 10㎛ 이하의 미세한 크기의 포자는 폐 속 깊숙이 침투되어 알레르기나 천식과 같은 심각한 과민성 호흡기계 증상을 초래한다(Horner et al., 1995; Baxter et al., 2011). 이와 같이 실내에 부유하고 있으며 호흡기 질환이 나타나는 대표적인 곰팡이에는 Cladosporium spp. Aspergillus spp, Penicillium spp, Alternaria spp가 있다(Cetinkaya et al., 2005; Ljaljevic-Grbic et al., 2008). 이와 같이 실내 부유 곰팡이의 실내 분포 특성 및 질병에 대한 많은 연구가 진행되어 왔으며, 또한 이에 따라 공기 중 부유 곰팡이의 항 곰팡이 연구가 진행 중이다.

 공기 중 부유 곰팡이 입자는 약 1∼4㎛ 크기이다. 곰팡이 입자는 필터로 여과되는데, 실제공기청정기에서는 필터 여재의 곰팡이의 증식을 막기 위해 금속입자로 코팅된 필터를 사용한다. 금속은 항균력이 뛰어나 많은 연구가 진행되었고 그 중 수은, 납 등의 금속은 인체 내독성이 평가 되어졌으며(Avakyan, 1967), 인체에 무해하다고 평가되어진 은의 항곰팡이 작용에 대해 현재까지 많은 연구가 진행 중이다(Kim et al., 2009).

 실제 은 나노입자가 곰팡이 입자에 적용되는 항곰팡이 원리는 다음과 같다(Erickson, 2009; Nasrollahi et al., 2011). 곰팡이 포자는 바깥 표면에 약 0.1∼0.4㎛의 두께의 세포벽으로 둘러싸여 있고 그 내부에 세포막으로 덮여져 있으며, 실제 곰팡이 입자의 살균 여부는 세포막의 손상이다. 항곰팡이 작용으로는 두 가지 원리가 있다. 첫 번째는 얇은 곰팡이 표면이 은입자 자체로 함입되어 세포막에 손상을 입히는 방식이다. 두 번째는 세포벽을 뚫고 들어간 은입자가 세포호흡으로 나온 과산화수소에 의해 은이온으로 이온화되고 음이온을 띄고 있는 세포막과 반응하여 그 구조를 변형시킴으로써 세포막에 손상을 입히는 방식이다.

 Yun et al(2009)은 공기 중 부유 곰팡이의 은 나노입자와의 항곰팡이 작용을 확인하였다. 은 나노입자가 10% 희석된 용액을 희석 비에 따라 항 곰팡이를 평가하였다. 부유 곰팡이 입자를 발생시킨 후, 포집한 포자입자 위에 항 곰팡이 용액을 떨어뜨려 확인하는 방법이다. 사용한 곰팡이 발생장치는 에어 젯과 회전에 의한 발생장치로 입자의 발생이 일정하지 않고, 10#/㎝³미만의 입자가 초기에 발생하였으며 시간에 따라 감소되었다(Lee et al., 2010). 이 연구에서는 액체 내 항곰팡이 연구이며 실제 공기청정기와 같이 장시간의 노출이 가능하지 않기 때문에 HEPA 필터에 적용시키기는 어렵다.

 본 연구에서는 곰팡이 부유화 장치를 이용해 공기 중 부유 곰팡이를 은 나노입자가 코팅된 필터 위에 포집하여 항곰팡이 작용을 확인하였다. 사용한 곰팡이 부유화 장치는 진동방식을 이용한 장치로 편심에 의한 원심력의 회전 진동방식이고(Ahn et al, 2012), 에어필터 위의 은 나노입자의 코팅은 스파크 방전을 이용한 공기 중 포집 방식이다(Joe et al, 2011). 사용하는 에어필터는 HEPA 필터로 0.3㎛ 이상의 입자의 포집이 가능하며, 이때 사용한 곰팡이의 종류는 한국 및 일본에서 사용하는 항곰팡이 저항성 시험 방법에 의거한 Cladosporium cladosporioides (C. cladosporioides)이다.

 또한 본 연구에서는 항곰팡이 평가를 위해 Colony counting method(CCM) 방법 및 Adenosine Triphosphate(ATP) 방법을 사용하였다. 일반적인 곰팡이 배양 방법인 CCM 방법이 배양 및 측정 시간이 2일 걸리는 반면, ATP 방법은 30분 이내에 측정이 가능한 신속진단 방법이다. 그래서 본 연구에서는 ATP 방법을 소개하고 이를 CCM 결과와 비교하여 검증하였다.

2. 실험 설계

2.1 곰팡이 입자 발생

 본 실험에서는 편심에 의한 원심력의 강제진동 방법에 따라 제작된 곰팡이 발생기를 사용하였다(Ahn et al, 2012). 곰팡이 발생기는 공기 유입부, 입자 배출부, 진동 발생부, 제어부로 구성되어 있고, fungal agar plate를 올려놓을 수 있는 원판과 입자가 부유 및 이동 할 수 있는 공간 덕트로 구성되어 있다. 진동 발생부 진동판에 곰팡이가 배양된 agar-plate를 설치 후, 진동 조절에 따라 곰팡이 포자 입자가 배지에서 분리 되어 공기 유입부에서 유입되는 공기로 인해 입자 배출부로 배출된다. 이 발생기의 최적 조건으로 시간을 10초 주기로 설정하고, 진동세기는 10voltage로 조절 할 수 있다. 이 조건으로 10#/cm³ 이상의 곰팡이 포자 입자가 약 30 분 동안 꾸준히 발생된다.

 곰팡이 발생기를 이용해 진동세기 10voltage, 시간주기 10초로 조절하여 30초 동안 발생시켰다. 발생된 곰팡이 입자는 최빈 입경(Mode di-ameter) 3.05㎛, 평균 입경(Mean diameter) 3.15 ㎛, 기하 표준 편차(Geometric standard deriva-tion)1.17, 총 입자 수는 (6.85±3.42)×10⁵  particles였다. 이때 필터에 포집한 곰팡이 입자는 배양시킨 결과, 7일 후 성장하였다.

2.2 시험 곰팡이

 본 실험에서는 실험 곰팡이로 Cladosporium cladosporioides (A.T.C.C; American Type Culture Collection; U.S.A)를 사용하였다(곰팡이 저항성 시험방법 Korean standard KS J 3201 / Japan standard JIS 2911). Nutrient broth에 곰팡이 가루를 혼합 후 약 일주일간 shaking incubator에 배양함으로써 곰팡이 용액을 만든다. 150×20mm petri dish에 곰팡이용 맥아 추출 한 천 MEA(malt extract agar)를 30ml씩 준비한다. 여기에 준비한 곰팡이 용액을 한천배지에 약 10ml를 넓게 부어주고 약 10일정도 배양한다. 배양 온도는 약 37℃ 습도는 40%를 유지한다.

2.3 시험 필터 준비

 스파크 방전기(Spark discharge System)를 이용해 발생시킨 은 나노입자를 HEPA 필터에 코팅시켜 은 나노입자 코팅 필터를 제작하였다. 스파크 방전의 전극으로 지름 3mm의 로드 타입은을 사용하였으며, 두 전극은 서로 같은 축으로 나열하고 10mm 이내의 공간을 둔다. 두 전극사이에 정전류 전원을 통해 일정한 전류가 공급되면 축전기에 전기적 에너지가 축적되며, 전극 양단 사이에 전압이 상승하게 된다. 전극 사이의 전압이 스파크 방전 개시 전압이 되면, 전극 사이의 공기 절연 파괴로 인해 순간적으로 축전기에 축전된 전기적 에너지가 전극 사이로 방전되어 스파크가 발생하게 된다.

 스파크 방전기 안으로 유입된 공기는 방전에 의해 방출된 전자와의 충돌에 의해 이온화된다. 이온화된 이송유체와 방출된 전자는 은 전극과 충돌을 일으키며 국부적으로 전극 표면의 온도를 녹는점 이상으로 높이고, 음극 스퍼터링(sputtering)이 일어나 일부의 은막대가 파괴되어 은입자가 떨어져 나온다. 고온에 의해 기화되어 전극 표면에서 탈착된 은 가스는 유동을 타고 방전영역을 벗어나며 급속히 냉각된다. 녹는점 이하의 온도에 노출된 과포화 상태의 기상의은 은 응축 및 성장을 통해 은나노 에어로졸이 된다(Oh et al, 2006).

 이렇게 제작된 은 나노입자는 HEPA 필터로 이동하여 필터 표면 위에 얹히게 되고 이것을 바로 은 나노입자 코팅 필터라고 일컫는다. 본 연구에서는 스파크 발생기 회로의 저항은 5kΩ 축전기 1μF로 구성한 RC 회로를 사용하였다.

 스파크 방전을 통해 은 나노입자를 HEPA 필터에 코팅시켰다. 발생시킨 은 입자의 입경별 수 농도는 Fig. 1와 같다. 발생된 은 나노입자는 최빈 입경(mode diameter) 32nm, 평균 입경(geometric mean diameter) 32nm, 기하 표준 편차(Geometric standard derivation) 1.52, 총 입자 수는 2.18×10⁷ particles/cc 였다. 은 나노입자 필터는 시간별 0, 10, 20, 25, 30분 코팅하였으며, Fig. 2(a)-(f)는 코팅된 필터의 15000배 확대한 SEM(JSM-6500F, JEOL, Japan) 이미지이다.

Fig. 1. Size distribution of Ag aerosol particle.

Fig. 2. SEM images of Ag nano particle coated filter ; coating time (a) 0min (b) 10min (c) 20min (d) 25min (e) 30min (f) 40min

2.4 실험 장치의 구성

 본 연구에서 실험장치의 구성은 Fig. 3과 같다. 크게 은 나노입자 코팅부, 곰팡이 발생부, 항곰팡이 측정부로 구성된다. 먼저 은 나노입자 코팅부와 곰팡이 발생부에 주입되는 공기는 오일트랩, 확산건조기(diffusion dryer), HEPA 필터로 구성된 청정공기 공급 장치를 통과한 건조된 청정공기를 사용하였다.

Fig. 3. Whole experiment setup.

 먼저 입자 코팅부에서는 2lpm의 공기를 주입하고 스파크 방전기를 이용해 필터에 은 나노입자를 코팅시킨다. 이때의 필터 사이즈는 4cm×4cm이고 스파크 방전에 사용한 전류는 1mA, 전압은 2kV이다. 곰팡이 발생부는 2lpm의 공기를 주입하여 곰팡이 입자를 발생시키고 이를 필터에 포집한다. 이때 항곰팡이 테스트를 위해 은 나노입자가 코팅된 필터와 처리가 되지 않은 필터에 각각 1lpm의 유량으로 나눠서 포집한다.

 항곰팡이 측정부에서는 ATP를 이용한 측정방식과 배양을 통한 CCM 측정 방식을 사용하여 항균 효율을 계산한다.

 은 나노입자의 크기 분포 및 입경별 입자 수농도는 에어로졸 중화기(aerosol neutralizer, soft X-ray charger, HCT, 4530), Differential mo-bility analyzer(DMA, TSI, 3085) 및 CPC(con-densation particle counter, TSI, 3022A)로 구성된 Scanning mobility particle sizer(SMPS, TSI, 3080)를 이용해 입경별 수농도를 측정하였으며, 곰팡이 입자의 크기 분포 및 입경별 입자수농도는 Aerodynamic particle sizer(APS, TSI, 3321)를 이용해 측정하였다.

2.5 항곰팡이 평가

 ATP를이용한측정방식은Relative Light Unit lumitester(RLU 측정기 PD-10N; NO.542101R; Japan)를 이용해 측정한다. ATP란 모든 생물의 세포 내 존재하여 에너지 대사에 매우 중요한 역할을 한다. ATP 한 분자가 가수분해를 통해 다량의 에너지를 방출하며 이는생물활동에사용된다. RLU 측정기는세균이에너지원으로 쓰고 있는 ATP를 Luciferin과 반응으로 빛을 발생시켜 그 빛의 강도를 측정하여 세균의 농도를 측정한다.

 lucipac(lucipac W for lumitester PD-10/PD-10N; Kikkoman Biochemifa Company; Japan)은 lucifer-in이 들어있는 통과 입자를 반응시킬 수 있는 면봉형태의 시험기이다.

 이 시험기를 이용해 필터 위의 곰팡이 입자를 닦아낸 후, lucipac 내부의 luciferin과 반응시킨다. 그리고 이 lucipac을 RLU 측정기에 넣어 빛의 강도를 측정한다.

 배양을 통한 CCM 측정 방식은 배양된 곰팡이의 군집수를 계산한다. 곰팡이가 포집된 필터를 가로2cm×세로1cm의 크기로 잘라낸 후, 이 필터를 팩에 넣어 고정시킨다.

 팩 내부에 30ml의 Nutrient broth(NB) 용액을 넣고 Stomacher (BagMixer by Interscience; StNom; France)를 이용해 약 10분간 10strokes/s의 세기로 입자를 털어낸다. 그리고 털어낸 입자를 Malt extract agar(MEA)에 10ml씩 넣고 4일간 배양한다.

3. 결과 및 토의

3.1 은 나노입자와 곰팡이 입자의 반응

 은 나노입자가 코팅된 필터 위에 곰팡이의 포자 입자를 포집하였다. 그림4는 은 나노입자가 0, 20, 40분 코팅된 필터 위에 포집된 곰팡이 입자의 SEM 이미지이다. 은 나노입자가 코팅되지 않은(0분) 필터 위에서 곰팡이의 포자 입자는 표면이 깨끗한 둥근 형태를 보였다. 은 나노입자가 20분 코팅된 곰팡이 입자는 표면이 거칠었고, 40분 코팅된 곰팡이 입자는 표면이 거친 형태를 띄며 일부가 찢어져 손상을 입었다. 이와 같이 은 나노입자를 이용하여 공기 중의 부유 곰팡이의 표면이 손상을 확인한 연구는 찾을 수 없었고, 반면 Jung 등(2009)에서는 열처리를 통해 유사한 형태로 곰팡이의 표면이 거칠어지고 손상을 입었음을 확인하였다.

 은 나노입자와 반응한 곰팡이 입자를 백믹서를 이용해 털어내었다. 털어낸 곰팡이 입자를 4일 동안 배양하였고, 배양한 곰팡이 입자는 은 나노입자 코팅 시간 0, 10, 20, 30분에 따라 Fig. 4(a)와 같이 성장하였다. 10일 후 곰팡이는 Fig. 5(b)와 같이 번식함을 확인하였다.

Fig. 4. SEM images of fungal particle on Ag filter (a) 0min (b) 20min (c) 40min

Fig. 5. Cultured fungi particles on Malt Extract Agar (a) After 4 days (c) After 10 days

3.2 항 곰팡이 효율 및 ATP를 통한 CCM의 검증

 은 입자 코팅 양이 많은 필터의 경우 실험 곰팡이의 CFU 및 RLU value는 감소하였다(Table 1), 이 결과를 x-y 그래프로 그리면 입자 코팅시간에 CFU와 RLU value가 비례함을 알 수 있다(Fig. 6). 따라서 ATP 측정을 통한 CCM의 결과를 도출할 수 있음이 검증되었다.

Table 1. Colony number and RLU value with Ag coating time.

Fig. 6. Correlation of CFU with RLU value.

 또한 곰팡이에 대한 은의 영향력을 살펴보기 위해 은 코팅시간에 따라 곰팡이 입자 한 개당 사용된 은 입자의 수를 계산하였다(Table 2). 이때 곰팡이 입자의 총 개수는 6.85x10⁵ particles로 일정하였다. 곰팡이 입자의 저감 효율(Fungicidal efficiency)은 RLU value 및 CFU로 확인하였다. 이때의 저감 효율 식은 아래와 같다. A는 RLU value 및 CFU 값에 해당한다.

Table 2. Ag nano-particle numbers per fungal particle with Ag coating time.

 곰팡이 입자의 저감 효율은 은입자 코팅 시간에 따라 증가하였고, 코팅된 은 나노 입자는 (2.18±0.04)x10⁷#/cm³이다. 은 코팅시간에 따라 곰팡이 입자 한 개당 은 입자의 수가 1.91x10⁶ 일때 RLU value는 99.79%, CFU 값은 99.99%의 효율을 보였다(Fig. 7).

Fig. 7. Fungicidal efficiency.

4. 결 론

 본 연구에서는 은 나노입자를 이용한 필터 위에 공기 중 부유 곰팡이를 포집하여 저감 효율을 확인하였다. 이 때 필터는 스파크 방전을 이용해 은 나노입자로 코팅하였다. 공기 중 부유 곰팡이는 생물학적으로 관여하는 포자입자로 존재하고 이 입자를 필터 위의 은 입자에 접촉시켜 항 곰팡이 효과를 확인하였다. 최소 조건으로 최빈 입경 32nm의 은 입자가 곰팡이 입자 1개당 1.91×10⁶개일 때 곰팡이 입자는 99% 이상의 효율을 보였다. 향후 에어 필터에 사용되는 은 입자의 최소 조건으로 적용시키기에 용이할 것이다. 또한 RLU value와 CFU의 관계를 확인함으로써 ATP 방법을 이용한 30분 이내의 항곰팡이 신속 평가가 가능함을 알 수 있었다.

감사의 글

 본 연구는 환경부 "차세대에코이노베이션사업"의 연구비 지원에 의해 수행되었습니다.