1. 서 론

 이산화탄소에 이어 2번째로 기여도가 높은 온실가스인 메탄은 무색, 무취 온실가스로, 공기 중에 5~15% 함유되어 있으면 폭발 위험성이 있으며,^1,2) 0.5% 메탄에 장기 노출 시 호흡곤란을 야기하는 유해가스이다.³⁾  대기 중 메탄 농도는 산업혁명 이전에는 700 ppb이었으나 현재는 1,745 ppb로 급격하게 증가하였다.⁴⁾ 메탄의 복사강제력은 0.48 W m^-2  이며, 100년 기준 지구온난화지수(Global Warming Potential, GWP)는 이산화탄소의 21~25배이다.⁴⁾ 특히 메탄의 체류시간은 12±3년으로 다른 온실가스에 비해 비교적 짧기 때문에, 20년 기준 GWP는 이산화탄소의 70배 이상이다.⁴⁾ 

 3대 주요 온실가스인 이산화탄소, 메탄 및 아산화질소의 발생원을 비교해보면, 이산화탄소는 에너지 공급, 산업 및 수송분야가 높은 비중을 차지하며, 아산화질소는 농업분야와 토양이용 및 바이오매스 연소과정이고,⁵⁾  메탄은 농업 및 화석연료 사용뿐만 아니라, 다른 온실가스와는 달리 폐기물 처리 분야가 주요 발생원이다.⁶⁾

 메탄은 유기물의 혐기적 분해 과정에서 메탄생성균에 의해 생성되며, 생물학적 작용에 의한 메탄 발생량은 총 발생량의 약 70~80% 정도 차지하는 것으로 추정되고 있다.⁷⁾ 한편, 메탄 제거는 주로 대류권에서의 OH Radical과의 반응(CH₄+OH∙→CH₃∙+H₂O)과 성층권에서 chlorine과의 반응(CH₄ +Cl∙→ CH₃∙+HCl)에 의해 소멸된다.⁷⁾ 또한, 호기적인 환경에서는 메탄은 유일 탄소원과 에너지원으로 이용하는 메탄산화균(methanotrophs)에 의해 이산화탄소로 최종 산화되는데,^8,9) 이러한 기작은 메탄의 주요 소멸기작이다.

 토양은 주요 메탄 발생원임과 동시에 소멸원으로 메탄 발생과 소멸은 모두 토양 미생물에 의한 생물학적 작용에 기인한다. 따라서 토양 미생물 중 메탄산화균은메탄의 지화학적 순환(biogeochemical cycle)에 중요한 역할을 담당한다.^8,9) 토성, 온도, 유기물 함량, 수분함량, pH, 식생 종류 등 토양 특성에 따라 메탄 발생속도와 메탄 소멸 (산화)속도는 상이하다.^7,8)  메탄 발생속도는 식생이 없는 토양은 3 g-CH₄ ha^-1d^-1이지만, 소택지와 논에서는 각각 약 700 g-CH₄ ha^-1d^-1과 약 1,000 g-CH₄ ha^-1d^-1으로 상대적으로 높음을 알 수 있다. 한편, 최대 메탄소멸속도는 경작지, 초지 및 산림토양은 228~1,659 g-CH₄ ha^-1d^-1이지만, 습지토양은 700,000 g-CH₄ ha^-1d^-1로 매우 높은 것으로 보고되었다.⁷⁾ 

 유기물이 혐기적으로 분해되면 메탄과 이산화탄소뿐만 아니라 암모니아, 황 화합물 (황화수소, 메르캅탄, 황화메틸 등) 등과 같은 악취가 동시에 생성되므로 매립가스 중에는 이들 악취가스들이 포함되어 있다. 악취 물질 중 암모니아는 메탄 산화에 영향을 부정적인 영향을 미치는 것으로 보고되었다.^10-12) Methane monooxygenase (MMO)는 메탄 산화 기작에 있어 methane을 methanol로 산화하는 주요 효소인데, 메탄에 비해 암모니아가 MMO와의 친화도 (affinity)가 높기 때문에 암모니아는 메탄 산화에 있어 경쟁적 저해제로 작용하는 것으로 보고된 바 있다.^13,14) 그러나 일부 연구자들이 암모니아에 의해 메탄 산화가 향상된다고 보고하는 등메탄 산화에 미치는 암모니아의 영향에 대한 정보는 많이 부족한 상황이다.^15-18) 

 본 연구에서는 매립지, 습지 및 논으로부터 근권 및 비근권 토양을 채취하여 메탄으로 농화배양한 후, 농화배양액의 메탄 산화에 미치는 암모니아 농도 영향을 정량적으로 분석하였다. 또한, MMO gene을 이용한 quantitative real-time PCR (qRT-PCR) 기법을 활용하여 메탄산화균 수에 미치는 암모니아 영향을 정량적으로 분석하였다.

2. 실험 재료 및 방법

2. 1. 토양 시료

 대한민국 공주에 소재한 폐기물 위생 매립지(LC), 금강 유역의 습지(RW) 및 파주의 논(RW)으로부터 식물뿌리 부근의 근권토양(RS)과 비근권토양(NRS)을 채취하였다.¹⁹⁾  채취한 토양은 ice box에 넣어 운반하였고, 실험에 사용하기 전까지 4^oC에서 보관하였다. 각 토양의 물리화학적 특성은 이전 논문에 자세히 기술하였다.¹⁹⁾

2. 2. 농화 배양 및 메탄 산화에 미치는 암모니아 영향

 토양시료를 2 mm sieve를 이용하여 입자가 굵은 토양을 제거한 후, 600mL 혈청병에 토양시료를 8g씩 넣었다. 각 혈청병에 nitrate mineral salts (NMS) 배지¹⁹⁾ 20 mL를 넣고 고무마개와 알루미늄 캡으로 밀봉하였다. 밀봉된 혈청병을 약 3분간 vortexing하여 토양과 배지가 골고루 혼합되도록 하였다. 밀봉한 혈청병에 유일탄소원으로 메탄가스(99%, Dong-A gases, Korea)를 최종 농도가 5%(v/v)가 되도록 주입한 후, 30^oC   180 rpm에서 배양하였다. 배양하면서 혈청병 headspace의 gas를 채취하여 메탄을 분석하여 농도가 20 ppmv 이하로 감소되면 후드 안에서 혈청병 고무마개를 열어 1시간 동안 aeration을 시켜 주었고, aeration 후 고무마개를 닫고 메탄가스를 상기와 동일한 농도로 재주입하였다. 질소와 인의 고갈에 따른 저해를 막기 위해 재배양을 2회 수행한 후 aeration 할 때 N과 P 농축액을 각각 1mL씩 넣어 주었다. NMS 조성은 MgSO₄∙7H₂O 1 g∙L^-1, CaCl₂∙2H₂O 0.295 g∙L^-1, KNO₃ 1 g∙L^-1, KH₂PO₄ 0.26g∙L^-1, Na₂HPO₄∙2H₂O 0.41 g∙L^-1, CuSO₄∙5H₂O 2.50mg∙L^-1이다. N, P 농축액은 N은 KNO₃를 20 g∙L^-1, P는 KH₂PO₄ 5.2 g∙L^-1과 Na₂HPO₄∙12H₂O 16.5 g∙L^-1로 제조하였다.

 각 배양액의 메탄 분해속도가 일정해진(steady-state에 도달한) 농화 배양액을 대상으로 메탄 분해에 미치는 암모니아 영향을 다음과 같이 조사하였다. 농화 배양액을 120-mL 혈청병에 5mL씩 분주하여 넣은 후, 황산암모늄 ((NH₄)₂SO₄) 시약을 이용하여 질소농도로 0, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg-N/bottle이 되도록 첨가하였다. 고무마개와 알루미늄 캡으로 혈청병을 밀봉한 후, 메탄가스 (99%, Dong-A gases, Korea)를 최종 농도가 5% (v/v)가 되도록 주입하였으며, 혈청병을 30^oC, 180 rpm에서 배양하면서 메탄 농도를 주기적으로 분석하였다. 1 mL gas-tight syringe를 이용하여 혈청병의 headspace에서 gas를 0.3 mL sampling하였고 sampling gas를 Wax column (Supelco, 30×0.32mm×0.25 μm)이 장착된 gas chromatography (Agilent 6850N, USA)의 flame ionization detector를 이용하여 분석하였다. 분석 온도는 oven 100^oC, injector와 detector는 각각 230^oC로 하였다. 메탄의 검량선 작성방법은 Lee et al.²⁰⁾에 자세히 설명되어 있다. 배양시간에 따라 메탄 농도를 plot하여 얻은 기울기로부터 메탄 산화속도를 계산하였다.

2. 3. DNA 추출 및 qRT-PCR을 이용한 메탄산화균의 정량 분석

 메탄 산화에 미치는 암모니아의 영향 실험을 완료한 후, 혈청병으로부터 배양액 1mL을 채취하고 14,000×g에서 5분간 원심분리하여 얻은 침전물에서 DNA를 BIO101 FastDNA SPIN Kit for soil (MP Biomedicals, USA)을 이용하여 추출하였다. DNA 추출은 BIO101 kit protocol을 따라 수행하였고 모든 샘플은 2 sets씩 추출하였다.

 메탄산화균을 정량적으로 분석하기 위해 qRT-PCR을 이용하였다. qRT-PCR의 standard를 작성하고자 pmoA gene은 Methylobacter luteus (NCIMB11914)을 이용하여 A189f (5′-GGN GAC TGG GAC TTC TGG- 3′)와 mb661r (5′-CCG GMG CAA CGT CYT TAC C- 3′) primer set을 사용하여 PCR하였다. 자세한 PCR 조건은 Lee et al.¹⁹⁾ 에 자세히 설명하였다. Gene copy number와 C_t(Threshold cycle)의 상관관계를 알아보고자 10배씩 희석한 standard sample을 3반복으로 qRT-PCR 수행하였다. Master mixture 조성은 template 3 L, distilled water 9.1 L, Power SYBR Green PCR Master mix(Applied Biosystems, USA) 12.5 L, 25 M primer 각 0.2 L이고, PCR condition은 95^oC에서 10분 후 95^oC 15 s, 60^oC 1 min, 77^oC 30 s를 40회 반복하였다. Signal detection은 77^oC에서 이루어졌다. 토양별 농화배양 sample속 메탄산화균을 정량분석 하고자, genomic DNA를 무희석, 1/10, 1/100 희석하였고, 희석한 sample을 각각 3sets씩 qRT-PCR 수행하였다. pmoA의 최저 검출한계점은 9 gene copy number이었다.

3. 결과 및 고찰

3. 1. 메탄 산화속도에 미치는 암모니아 농도 영향

 매립지에서 채취한 근권 토양과 비근권 토양을 접종원으로 이용하고 메탄을 유일 탄소원으로 공급하면서 얻은 농화배양액의 메탄 분해에 미치는 암모니아 농도의 영향을 Fig. 1에 도시하였다. 매립지 근권 토양의 경우, 암모니아 농도가 높아질수록 메탄 분해가 저해되었으며, 4 mg-N/bottle을 첨가한 조건에서는 전혀 메탄이 분해되지 않았다. 매립지 비근권 토양의 경우에도 근권 토양과 마찬가지로 암모니아 농도가 증가할수록 메탄 분해가 천천히 진행되었으며, 2mg-N/bottle 조건에는 메탄 분해속도가 매우 느려졌고, 4mg-N/bottle을 첨가한 조건에서는 전혀 메탄이 분해되지 않았다.

Fig. 1.

 매립지, 습지 및 논으로부터 근권과 비근권 토양을 채취하여 이를 접종원으로 이용하고 메탄을 공급하여 배양한 농화 배양액에 메탄과 암모니아를 동시에 공급한 조건에서 메탄 산화속도를 구하여 Fig. 2에 도시하였다. 근권과 비근권 토양 시료 사이의 메탄 산화속도의 유의미한 차이는 보이지 않았다. 암모니아를 첨가하지 않는 메탄만을 첨가한 조건에서의 메탄 산화속도와 비교하여, 암모니아 첨가량이 1 mg-N/bottle까지는 메탄 산화속도는 거의 유사하거나 약간 감소하는 경향을 보였다. 그러나, 암모니아 첨가량이 2mg-N/bottle인 조건에서는 메탄 산화속도가 급격하게 감소하였고, 암모니아 첨가량이 4 mg-N/bottle인 조건에서는 메탄이 거의 분해되지 않았다. 또한, 메탄 산화에 미치는 암모니아의 영향은 근권과 비근권 토양 시료 종류에 무관하게 유사한 경향을 보였다.

Fig. 2.

 메탄산화균에 의해 메탄은 우선 메탄올로 산화된 다음, 최종적으로 이산화탄소까지 완전 산화된다.⁸⁾ MMO는 메탄 산화 기작에 있어 첫번째 단계인 메탄을 메탄올로 산화하는 주요 효소인데, 메탄에 비해 암모니아가 MMO와의 친화도 (affinity)가 높기 때문에 암모니아는 메탄 산화에 있어 경쟁적 저해제로 작용하는 것으로 보고된 바 있다.^13,14) 또한, 토양에서 질산화균의 작용으로 생성된 암모니아 산화 대사산물 (아질산염 혹은 질산염)에 의해 메탄산화균의 메탄 산화속도가 감소되는 것이 보고되고 있다.¹⁷⁾

3. 2. 메탄산화균 군집 밀도에 미치는 암모니아 영향

 메탄을 유일 탄소원과 에너지원으로 활용하여 생장하는 세균을 메탄산화균 혹은 메탄 영양균 (methanotrohic bacteria)이라 한다.⁸⁾ 메탄산화균은 type I (gamma proteobacteria에 속함)과 type II (alpha proteobacteria에 속함)로 구분된다.⁸⁾  Methylomonas, Methylomicrobium, Methylobacter, Methylocaldum, Methylophaga, Methylosarcina, Methylothermus, Methylohalobius 및 Methylosphaera 등이 type 1에 속한다.²¹⁾ 또한, Methylocystis, Methylocella, Methylocapsa 및 Methylosinus등은 type II 메탄산화균에 속한다.²¹⁾ 메탄산화균은 그람 음성의 호기성 세균으로, methane monooxygenase(MMO)라는 효소를 이용하여 메탄을 메탄올로 산화하고 최종적으로는 이산화탄소로 광물화 (mineralization)한다.⁸⁾ 메탄 산화에 가장 중요한 역할을 담당하는 MMO는 세포막에 존재하는 particulate MMO (pMMO)와 세포질에 존재하는 soluble MMO (sMMO)의 2종류가 있다.²²⁾ pMMO는 Methylocella를 제외한 모든 메탄산화균에 존재하나, sMMO는 type II와 일부 type I 메탄산화균에만 존재한다. pMMO를 가진 메탄산화균은 sMMO를 가진 메탄산화균에 비해 빠르게 생장하고 메탄에 대한 특이성이 높다. pMMO의 주요 기능 유전자인 pmoA 유전자는 호기성 메탄산화균의 군집 다양성 및 군집 밀도를 비교하는 연구 등 메탄산화균의 생태학적 연구에 유용하게 사용되고 있다.

 본 연구에서도 메탄산화균 군집 밀도에 미치는 암모니아의 영향을 규명하고자, pmoA gene을 target으로하여 qRT-PCR을 수행하였다(Fig. 3). 암모니아를 첨가하지 않는 조건의 pmoA gene copy number와 비교했을때, 암모니아를 첨가한 조건에서 근권 토양의 경우는 감소하였고, 비근권 토양의 경우는 증가하였다. 암모니아가 공존하면 메탄산화균에 의한 메탄 산화는 저해를 받으나 (Figs. 1, 2), 메탄산화균 군집 밀도는 암모니아에 의해 영향은 근권과 비근권 토양에서 서로 상이한 결과가 보였다 (Fig. 3). 기존의 대부분의 연구는 대부분 암모니아는 메탄 산화에 있어 경쟁적 저해제로 작용하기 때문에 암모니아 공존에 의해 메탄 산화가 저해된다고 보고 하였다.^13,14) 그러나 일부 연구자들은 메탄산화균이 암모니아를 질소원으로 이용하여 성장이 향상되기 때문에, 암모니아에 의해 메탄 산화가 향상된다고 보고하였다.^15-18) 또한, 암모니아를 기질로 이용하는 질산화균이 암모니아 산화과정에서 메탄을 산화할 수 있기 때문에, 암모니아가 메탄이 공존하는 경우, 메탄은 메탄산화균 뿐 만 아니라 질산화균에 의해서 산화될 수 있기 때문에 메탄 산화속도가 증가될 수도 있다고 고찰되고 있다.^15-18)

Fig. 3.

 Reay와 Nedwell1⁷⁾은 산림 토양을 대상으로 메탄 산화에 미치는 무기질소 종(암모늄, 질산염, 아질산염)의 영향을 조사한 결과, 질산염에 의한 메탄 산화 저해 효과가 암모늄 혹은 아질산염에 의한 저해 효과보다 휠씬 큼을 보고하였다. 또한, 질산염에 의한 메탄 저해 기작은 MMO 효소에 의한 메탄 산화에 있어 경쟁적 저해제로 작용하기 때문임을 밝혔다. 즉, 메탄(기질)과 효소가 결합하는 active site에 질산염이 결합하기 때문에 메탄 산화가 저해 받는 것이다. 본 연구에서 메탄분해에 미치는 암모니아 영향 실험 종료 후 배양액에 잔류하는 암모늄, 아질산염 및 질산염의 농도를 분석한 결과, 첨가한 암모니아가 대부분 질산염으로 산화된 것으로 확인되었다 (결과 미제시). 따라서, 본 연구에서 사용한 메탄 분해 농화배양액 중에 암모니아를 산화할 수 있는 아질산산화세균 및 질산산화세균이 혼합되어 있고, 이들에 의한 암모니아의 최종산화물인 질산염에 의해 MMO 효소가 경쟁적으로 저해 받아 메탄 분해 속도가 감소한 것으로 사료된다. 향후 이러한 가설을 입증하기 위한 추가 연구가 필요하다.

 본 연구에서 얻은 정보는 향후 매립지와 같이 메탄과 암모니아가 동시가 배출되는 환경에서 온실가스인 메탄과 악취물질인 암모니아를 동시에 저감하기 위한기술을 개발하는데 유용한 기초 정보로 활용 가능할 것으로 판단된다.

사 사

 본 연구는 교육과학기술부 한국연구재단 국가지정연구실(R0A-2008-000-20044-0) 연구비 지원에 의해 수행되었으며 이에 감사 드립니다.