1. 서 론

천식은 만성기도질환 중 하나로 기침, 호흡곤란 등 과 같이 호기중에 나타나는 흔한 질병으로 크게 숙주 인자와 환경인자에 영향을 받아 발생을 한다. 숙주인자 로는 성별, 유전, 비만 등이 있으며 환경인자로는 휘발 성 유기화합물, 알레르겐, 실외 또는 실내 대기오염 등 다양한 요인이 존재한다. 이 중 집먼지진드기, 진균, 꽃 가루 등의 알레르겐은 천식의 증상을 증가시키는 역할 을 한다(KAAACI et al., 2015;Park, 2018;Cho, 2012).

특히 진균은 생활환경에 존재하는 대표적인 생물학 적 유해인자로 알려져 있으며, 진균증, 폐렴, 피부 감염 에 따른 피부질환 등을 질병(Bush et al., 2006;Panda, 2004;Kochhar, 2015;Karkowska-Kuleta et al., 2009) 을 일으키고 실내에 정착하여 군집을 이루면 mVOC (microbial volatile organic compounds)를 발산하여 두 통과 불쾌감을 유발시킨다(KOSIE, 2014). 또한, 가구 와 벽지 등에 서식하면 변색을 일으켜 미관 및 재산상 피해를 주기도 한다. 진균의 포자와 균사는 키틴, 글루 칸 등으로 구성되어 있어 인체의 기도에 노출될 경우 재채기, 기침, 천식, 알레르기 반응 등을 유발할 수 있 는 대표적인 알레르기 원인이다(Knutsen, et al., 2012;Pourfathollah, et al., 2014;Chowdary, et al., 2011). 그 렇기 때문에 병원에 자주 입원해야 하는 천식이 심한 환자들의 경우 일반적으로 진균에 민감하다(O'Driscoll et al., 2005).

이렇듯 천식환자의 증상에 진균이 영향을 미치기 때 문에 2017년부터 어린이 천식환자 가정집과 성인 천식 환자 가정집의 실내 공기 중에 존재하는 부유진균에 대한 연구를 수행하였다(Ahn et al., 2018). 본 연구에 서는 2017년 4월과 10월에 성인 천식환자가 거주하는 가정의 부유진균의 농도와 진균 종의 다양성에 대한 기초 정보를 얻고자 실내 공기를 포집하여 조사하였다.

2. 연구방법

2.1 공기 시료 포집 및 진균 순수분리

2017년 4월 경기도 3가구, 10월 경기도 2가구, 서울 특별시 1가구의 성인 천식환자 가정집 총 6가구를 방 문하여 천식환자가 주로 생활하는 공간인 거실과 침실 그리고 실외 공기를 포집하였다. 공기 포집은 Fig. 1과 같이 공간 한 가운데에서 진행하였다. 실내 공기 포집 은 ISO 16000-18에 기반한 충돌법을 이용한 포집기 (KAS-110, Kemik Corporation, Korea)로 진행하였다. 포집기의 높이는 1.0~1.5 m에서 수평을 맞추어 유량 28.8 L/min로 3분간 포집을 3회 반복하여 포집하였고 (Ahn et al., 2017;ISO, 2011), 공기포집에 사용한 배양 배지는 dichloran glycerol agar (DG-18 agar, MBcell, USA)를 사용하였다. 또한, 실내 공기를 포집하는 과정 에 온·습도계(Testo 410-2, Testo AG, Germany)를 사용 하여 포집 장소에서 온도와 습도를 측정하였고, 공기를 포집한 배지는 25°C 배양기에서 7일간 배양하였다. 그 후 자라난 진균의 균총을 계수를 하여 농도를 계산하였 고, 진균의 종 동정을 위해서 단포자 분리를 수행하고 같은 배양배지인 DG-18 agar에 순수 분리를 하였다.

2.2 형태학적 및 분자생물학적 동정

순수 분리된 진균의 형태학적 특성을 알아보고자 진 균을 배양하는 배지인 PDA에 25°C에서 7일간 배양 후 균총 형태, 색, 생육 정도 등을 관찰하였다. 그 후 광학현미경(Axioskop40; Carl Zeiss, Germany)과 주사 전자현미경(Sigma500, Carl Zeiss, Germany)으로 진균 의 포자와 균사 등의 미세구조를 관찰하였다. 순수 분 리된 진균의 분자생물학적 특징을 알아보기 위해서는 Kim의 논문에 나온 genomic DNA추출 방법을 참조하 여 genomic DNA를 추출하였다(Kim et al., 1999). 추 출된 DNA로부터 ITS (internal transcribed spacer) rDNA region (White et al., 1990), β-tubulin gene (Yun et al., 2009), 28S rDNA gene (White et al., 1990) 등 을 사용하여 각각 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하였다. 증폭된 DNA 산물은 Purification Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사 용하여 정제한 후 마크로젠사(Seoul, Korea)에 의뢰하 여 DNA 염기서열을 분석 후 분자생물학적 동정을 위 해 미국 National Center for Biotechnology Information 의 웹에 있는 BLAST 프로그램을 사용하여 DNA 데 이터베이스에 등록되어 있는 진균들과 상동성을 비교 하여 분자생물학적 동정을 수행하였다. 계통분석을 위 해서는 분리 균주와 관련된 taxon의 염기서열을 NCBI 의 GenBank에서 다운받아 MEGA 6 프로그램(Tamura et al., 2013)을 이용하여 염기서열의 유사도 및 phylogenetic analysis를 수행하였다. 계통도는 neighborjoining 방법으로 분석하였고 계통도 가지의 clade 신뢰 도는 1,000번의 bootstrap resampling을 수행하여 평가 하였다(Saitou and Nei, 1987).

3. 결과 및 고찰

3.1 천식환자 가정집의 온도와 습도

2017년 4월과 10월 경기도 5곳과, 서울특별시 1곳의 성인 천식환자 가정집의 실내(거실, 침실)와 실외의 공 기를 포집하였다. 실내 공기를 포집하는 동시에 온도와 습도를 측정하였으며 그 결과는 Table 1과 같다. 봄철 천식환자 가정집 실내 측정 공간 중 평균 실내 온도는 거실 21°C, 침실 23°C이며, 평균 실내 습도는 거실 65%, 침실 54%였다. 실외 평균 온도는 22°C, 평균 습 도는 56%로 실내와 차이가 없었다. 가을철 천식환자 가정집 실내 측정 공간 중 평균 실내 온도는 거실 23°C, 침실 24°C이며, 평균 실내 습도는 거실 42%, 침 실 43%였다. 실외 평균 온도는 22°C, 평균 습도는 36%였다. 봄철과 가을철의 실내 공간의 평균 온도는 차이가 없었으나, 평균 습도는 거실에서 23%, 침실에 서 11%으로 봄철 천식환자 가정집의 실내 공간이 더 높았다.

3.2 부유진균 농도 비교

4월과 10월의 성인 천식환자 가정집의 공기 중 진규 농도는 Table1과 같다. 봄철 천식환자 가정집 실내 측 정 공간 중 평균 부유진균 농도는 거실 225 CFU/m³, 침실 230 CFU/m³이며, 실외 평균 부유진균 농도는 319 CFU/m³이었다. 이는 같은 해 4월 다른 곳에서 조 사된 거실 125-277 CFU/m³, 침실 163–311 CFU/m³의 실내 부유진균 농도 범위와 유사하였다(Ahn et al., 2018). 가을철 천식환자 가정집 실내 측정 공간 중 평 균 부유진균 농도는 거실 728 CFU/m³, 침실 957 CFU/ m³이며, 실외 평균 부유진균 농도는 1,063 CFU/m³이 었다. 가을철 천식환자 가정집 실내 공간의 평균 부유 진균 농도는 모두 실내공기질 관리법 시행규칙 중 권 고기준인 곰팡이 500 CFU/m³를 초과하였다(ME, 2018). 봄철 천식환자 가정집의 부유진균의 실내·외를 비교하 였을 때, 거실 0.80, 침실 0.72로 실내·외 비가 모두 1 을 초과하지 않았다. 가을철 천식환자 가정집의 부유진 균의 실내·외를 비교하였을 때, 거실 0.68, 침실 0.90로 실내·외 비가 모두 1을 초과하지 않았다. 가을철의 경 우 바람이 많이 불고 낙엽 등 식물체에 진균이 번식하 기 쉬워서 진균 포자가 공기중에 부유하기 쉬운 환경 이기 때문에 실내의 진균 농도가 높게 나온 것으로 사 료된다. 천식환자의 경우 가을철 외부 외출을 삼가하고 공기청정기 등을 사용하여 집안의 공기중 부유 진균의 농도를 낮추는 것이 진균에 대한 노출을 줄이고 천식 증상을 악화시키지 않도록 하는 방법이 될 것으로 사 료된다.

3.3 부유진균 종 비교

2017년 봄과 가을의 성인 천식환자 가정집 공기에서 포집한 부유진균 총 70개를 순수 분리 하였으며 이를 분자생물학적 방법으로 분석한 결과, 4월 성인 천식환 자 가정집의 공기에서 총 4속 11종의 진균이 분리되었 으며, 10월 성인 천식환자 가정집에서는 총 10속 27종 의 진균이 분리되었다(Table 2). 이는 가을철에 공기 중에 진균의 농도도 높지만 진균의 다양성도 높다는 것을 보여준다. 속 수준에서 보았을 때 Penicillium속에 속하는 종이 가장 많이 존재하였다. 이는 같은 해 4월 다른 곳에서 조사한 부유진균에 대한 동정 결과와 유사 하다(Ahn et al., 2018). 이 속에 속하는 진균은 Aspergillus 속과 더불어 포자를 많이 형성하여 건조한 포자 를 공기 중에 쉽게 대량으로 부유시킬 수 있어서 높은 농도로 공기 중에 존재 할 수 있으며 이 경우 인체노출 가능성이 높아진다. 봄과 가을철에 공통으로 존재한 종 은 Penicillium chrysogenum 외 P. multicolor 이었다. P. chrysogenum은 항생물질 페니실린을 생산하는 종으 로 잘려져 있으며 실내공기중에 일반적으로 존재하는 종인데 특히 습하거나 누수가 있는 건물에서 많이 발 견되며(Anderson et al., 2011) penicilliosis를 일으킨 것으로 알려졌다(Avilés-Robles et al., 2016). P. multicolor의 인체위해성은 아직 잘 알려지지 않았으나 효소 나 물질이 분리에 대한 연구 보고가 있다(Flood and Kondo, 2004;Fujimoto et al., 2009). 조사된 진균 중 Aspergillus niger는 aspergillosis (Person et al., 2010),Cladosporium cladosporioides는 phaeohyphomycosis (Vieira et al., 2001), Penicillium citrinum은 폐렴(Mok et al., 1997) 등을 각각 일으킨 것으로 보고 되었다.

동정된 종 5 종의 진균(Arthrinium marii, Penicillium austrosinicum, P. concavorugulosum, P. exsudans, P. johnkrugii)이 국내에 미기록 종으로 분석되었다. A. marii로 동정된 DUCC5609균주의 균총은 PDA에서 25°C 7일간 배양하였을 때 생장이 빨랐으며(85 mm), 연한 회색 또는 아이보리색의 균사가 부분 부유하여 생장하였다(Fig. 2A). 광학현미경으로 DUCC5609균주 를 관찰하였을 때 연한 갈색 또는 갈색의 타원형의 포 자(5~6 × 2~2.5 μm)가 불규칙적으로 존재하였다(Fig. 3A). 또한, 28S rDNA region을 분석한 하였을 때, Arthrinium marii (KF144948)과 100% 상동성을 나타났 다(Fig. 4A). P. concavorugulosum로 동정된 DUCC5610 균주는 PDA에서 25°C 7일간 배양하였을 때 균총은 노란색의 균사로 생장하였다(Fig. 2B). 주사전자현미경 으로 DUCC5610균주를 관찰하였을 때 다발형태인 1.5~2.0 × 1~1.5 μm 크기의 타원형 포자가 3~4개 연결 한 상태로 존재하였다(Fig. 3B). DUCC5610균주를 beta-tubulin region을 분석하였을 때, Penicillium concavorugulosum (KF196854)와 100% 상동성을 보였다 (Fig. 4B). P. exsudans로 동정된 DUCC5011균주는 PDA에서 25°C 7일간 배양하였을 때 올리브색에서 흰 색으로 균사가 생장하였다(Fig. 2C). 주사전자현미경으 로 DUCC5011균주를 관찰하였을 때 2~2.5 × 3~3.5 μm 크기의 타원형의 포자가 3~6개 연결된 형태로 존재하 였다(Fig. 3C). DUCC5011균주를 beta-tubulin region을 분석하였을 때, Penicillium exsudans (KX885042)와 100% 상동성을 보였다(Fig. 4B). P. austrosinicum로 동정된 DUCC5612균주는 PDA에서 25°C 7일간 배양 하였을 때 균총은 오렌지색 균사위에 녹색의 가루형 태의 포자가 존재하는 형태로 생장하였으며(Fig. 2D), 주사전자현미경으로 균주를 관찰하였을 때 1~1.5 × 2~2.5 μm 크기의 타원형 포자가 4~6개 체인 형태로 존재하였다(Fig. 3D). DUCC5612균주를 β-tubulin gene region을 분석한 결과, Penicillium austrosinicum (KX885041)과 100% 상동성을 나타내었다(Fig. 4B). P. johnkrugii로 동정된 DUCC5613균주를 PDA에서 25°C 7일간 배양하였을 때 균총의 색이 오렌지 또는 노란색의 균사에서 녹색의 균사로 원형을 이루며 생장 하였다(Fig. 2E). 주사전자현미경으로 DUCC5613균주 를 관찰하였을 때 포자의 크기가 1~1.5 × 2~2.5 μm인 타원형의 포자가 5~10개 연결된 상태로 존재하였다 (Fig. 3E). DUCC5613균주를 β-tubulin gene region을 분석한 결과, Penicillium johnkrugii (JN686381)과 100% 상동성을 보였다(Fig. 4B). 천식환자 가정집의 실내공 기에서 동정된 국내 미기록 진균의 생체시료는 국립생 물자원관에 기탁하여 DUCC5609균주는 NIBRFGC 000502137, DUCC5610균주는 NIBRFGC000502147, DUCC5011균주는 NIBRFGC000502141, DUCC5612 균주는 NIBRFGC000502140, DUCC5613균주는 NIB RFGC000502142 번으로 각각 기탁번호를 부여 받았다..

국내 미기록 진균인 A. marii, P. austrosinicum, P. concavorugulosum, P. exsudans, P. johnkrugii에 대한 인체 위해성 정보는 존재하지 않았으나, Arthrinium속 은 중국에서 대나무와 갈대의 줄기 병반으로부터 분리 되었다고 보고되었다(Jiang et al., 2018). 또한, Arthrinium yunnanum은 대나무 종의 하나인 Phyllostachys heteroclada에 bamboo blight disease를 일으킨 다고 보고되었다(Yang et al., 2019). 본 연구에서 발견 한 4종의 국내 미기록 진균이 포함된 Penicillium속에 는 인체에 다양한 질병(심부진균증, 호흡기감염, 천식 등)을 일으키는 종이 존재한다고 알려졌다(Peto et al., 1988;Vanittanakom et al., 2006;Chowdhary et al., 2016;Bundy et al., 2009;Licorish et al., 1985). 모두 포자를 잘 형성하기 때문에 공기 중에 부유하기 쉽고 호흡기에 접촉 될 때 천식환자들의 기도를 자극하여 증상을 가중시킬 가능성도 배제할 수 없다고 사료된다. 향후 이들 미기록종에 대한 생물학적 정보가 연구되어 야 할 것이다.

4. 결 론

2017년 4월과 10월 총 6곳의 성인 천식환자 가정집 의 실내 공기 중 부유진균을 포집하여 농도와 진균종 다양성을 연구하였다. 10월의 성인 천식환자 가정집의 실내 공기 중 부유진균의 평균 농도는 모두 실내공기 질 관리법 시행규칙의 권고기준인 500 CFU/m³를 초과 하였다. 총 70개의 진균을 순수 분리하였으며 genomic DNA를 추출 후 각각의 프라이머를 사용하여 분자생 물학적 방법으로 분석한 결과, 4월 성인 천식환자 가정 집의 공기에서 총 4속 11종의 진균이 분리되었으며, 10월 성인 천식환자 가정집에서는 총 10속 27종의 진 균이 분리되었다. 이 중 4월 1종(Arthrinium marii), 10 월 4종(Penicillium austrosinicum, P. concavorugulosum, P. exsudans, P. johnkrugii)이 국내 미기록 진균으 로 확인되었다. 국내 미기록 진균 5종에 관한 인체 위 해성에 대한 자료는 존재하지 않았지만 Penicillium 속 은 인체에 질병을 유발시키는 속으로 알려져 있다. 그 러기 때문에 천식환자 가정집의 실내 공기에서 부유진 균을 정량적인 수준인 농도관리 뿐만 아니라, 정성적인 수준인 종 수준에서 관리가 필요하다고 사료된다.