1. 서 론
2018년 기준 전국의 돼지사육농가는 6,188가구로 전 년 대비 1,782 가구가 증가하였으며 사육두수도 10,513천 두에서 11,332천 두로 819천 두 이상 급격히 증가하였다(MAFRA, 2019). 이에 따라 양돈농가를 중 심으로 악취민원도 급격히 증가하여 2017년 22,851 건 에서 2018년 32,452 건으로 42% 이상 증가하였다 (ME, 2018).
일반적으로 돈사에서 발생되는 악취는 돈분뇨의 혐 기 발효 과정에서 Eubacterium sp., Streptococcus sp., Peptostreptococcus sp., 및 Clostridium sp. 등의 미생물 이 생성하는 phenol, indole과 같은 대사물질에서 기인 하는 것으로 보고되고 있으며, 돈사내부에서는 황화수 소(41.3%), 4-methylphenol (13.9%) 성분이, 분뇨저장 조에서는 황화수소(33.7%), 암모니아(18.8%), 3- methylindole (15.7%) 성분이 악취기여도가 높은 것으 로 조사되었다(Shin et al., 2016).
돈사에서 발생되는 악취를 제어하는 방안으로 전체 환기에 의한 대기비산, 국소배기시설을 이용한 강제포 집 및 처리, 완전밀폐 돈사시스템 구축, 발생원 악취저 감 미생물살포, 탈취제 분무법, 장내 균총변화에 의한 악취저감 등 다양한 방법들이 연구되었다(NIER, 2017). 특히, 악취발생원에 직접 미생물제제를 살포하 거나 가축에 급여하는 방식은 화학약품을 사용하지 않 으면서 근원적인 악취발생을 저감시킬 수 있다는 측면 에서 친환경적이고 에너지 절감효과를 기대할 수 있을 것이다.
Ko et al. (2015a)의 연구에 의하면 Pseudomonas sp., Pseudomonas anguilliseptica 등을 활성화시킨 수 분조절제를 돈분 퇴비발효과정에 살포하였을 때 91.4%의 암모니아 저감효과가 나타났으며, Bacillus sp. Pseudomonas sp. 등이 우점종으로 활성화된 돈분 처리공정에서 암모니아 발생 농도는 각각 91.2% 이상 저감된 것으로 보고되었다(Ko et al., 2015b). 또한, Lactobacillus acidophilus, Bacillus subtilis, Clostridium butyricum을 배양하여 육계에 투여했을 때에도 대조구 대비 암모니아 저감율이 향상된 것으로 나타났다. (Zhang and Kim, 2014) 그 외에도 Bacillus amyloliquefaciens라는 생균제 strain이 육계의 변 냄새 제거 및 성장률과 장내균총 조성을 변화시킨다는 연구사례 도 있다(Ahmed et al., 2014).
한편, 갯벌은 육상환경과 해상환경이 조수간만의 차 에 의해 공존하는 공간으로 호기적 조건과 혐기적 조 건이 동시에 형성되어 다양한 종류의 미생물이 서식하 고, 높은 자정능력을 가지고 있어 육지에서 발생하는 각종 오염물질을 정화하는 기능을 가지고 있다(Cho et al., 2005). 특히, 순천만 갯벌은 이사천과 동천이 합류 되는 지점에서 시작되어 전국에서 가장 넓은 약 5.4 km2의 갈대군락을 형성하고 있어, 유기물을 전자공 여체로 이용하는 갈대근권 미생물이 다양하게 서식하 고 있는 것으로 알려져 있으며(Lee et al., 2001), Kim et al. (2005)은 다환방향족화합물(polycyclic aromatic hydrocarbons; PAH) 분해균으로 Burkholderia sp. SCB1 과 Alcaligenes sp. SCB2 등을 순천만 갯벌에서 분리 하였다고 보고하였다.
이러한 연구 성과들을 기반으로 살펴보면, 갯벌에는 유기물을 기질로 삼아 악취원인물질인 암모니아를 산 화하거나 황화합물을 환원시키는 다양한 미생물이 서 식할 것으로 추정되며, 특히 순천만은 미생물 생태다양 성이 풍부할 것으로 추정된다. 따라서, 본 연구는 친환 경적인 돈사 악취제어방안의 하나로 악취분해 미생물 살포에 의해 축사내부의 근원적 악취발생을 저감시키 는 기술개발의 이론적 배경을 마련하기 위해 순천만 갯벌에서 서식하는 미생물을 분리하여 대표적 악취물 질인 암모니아와 황화합물에 대한 분해능을 평가하고 생장특성을 파악하였다.
2. 연구 방법
2.1 균주 분리
본 연구에 사용될 악취물질 분해 미생물은 순천만 갯벌지역에서 분리하였다. 분리방법은 순천만 갯벌지 역(34°52′34″N, 127°30′33″E)에서 표토층을 걷어내고 약 10~30 cm 깊이에서 멸균된 삽을 이용하여 약 1 kg 의 갯벌을 채취 후 멸균봉지에 담아 냉장 운반한 후 0.9%의 멸균 생리식염수에 채취한 시료(3.0 wt%)을 넣 고 120 rpm에서 10분간 교반하였다. 교반 후 30분간 정치시킨 후 상등수 0.1mL를 starch·casein 고체배지 (soluble starch 10.0 g, casein 1.0 g, K2HPO4 0.5 g, agar 15.0 g, D.I water 1,000 mL, pH 7.0~7.5)에 각각 평판 도말하고 25°C 배양기에서 5일간 배양하였다. 배양된 균주의 colony 색과 형태로 분류하여 streaking 기법을 통해 각각 분리하여 3회 이상 계대배양 한 후 단일 colony가 배양되도록 순수 분리하였다.
2.2 암모니아 및 황화합물 분해능 평가
본 연구에서 분리균주의 암모니아화합물과 황화합물 에 대한 분해능 평가를 위해 황화합물배지(yeast extract 2.0 g, Na2S2O3 5.0 g, KH2PO4 1.5 g, Na2HPO4 4.5 g, MgSO4·7H2O 0.1 g, NH4Cl 0.3 g, D.I water 1,000 mL, pH 7.0)(Kim et al., 2004)와 Table 1과 같은 암모니아배지(Lee and Lee, 2014)에 agar 1.5%를 첨가 한 고체배지를 조제하였으며, 순수분리된 균주를 멸균 침을 이용하여 각각의 배지에 접종한 후 콜로니 형성 여부를 통하여 분해능을 평가하였다.
2.3 균주 동정
암모니아화합물과 황화합물 배지에서 가장 뚜렷한 colony를 형성하는 균주를 선별하여 염기서열 분석을 통해 상동성을 확인하였다. 염기서열 분석은 27F (5'- AGA GTT TGA TCC TGG CTC-3')와 1492R (5'- GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3') primer를 사용 하여 PCR 증폭을 하고 NCBI (National Center for Biotechnology Information, USA)의 blast search program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)을 통해 기 존에 보고된 미생물의 16S rRNA 염기서열과 상동성 을 비교하여 분리된 균주를 동정하였다.
2.4 생장특성 파악
2.4.1 최적 pH 조사
선별된 균주의 배양을 위한 최적 pH를 알아보기 위 하여 300mL 삼각플라스크를 이용하여 starch·casein배 지 100 mL에서 전 배양된 균주를 3% 농도로 접종하 여 각 초기 pH 조건에서 배양하여 성장을 관찰하였다. pH 범위는 pH 3, pH 5, pH 7, pH 9, pH 11로 2 NNaOH와 6 N-HCl로 조절하였고, 30°C, 120 rpm의 조 건의 교반 배양기에서 배양하였다. 배양 시간에 따른 균체의 성장은 2시간마다 배양액 1mL를 채취하여 자 외선 흡광광도기(UVmini-1240, SHIMADZU, Japan) 를 이용하여 600 nm에서 optical density를 측정하였고, 이때 배양액의 pH 변화는 pH meter (Ecomet P25, ecPlaza, Korea)를 이용하여 조사하였다.
2.4.2 최적 온도 조사
또한, 선별된 균주의 최적 배양 온도를 조사하기 위 해 300 mL 삼각 플라스크를 이용하여 starch·casein배 지 100 mL에서 전 배양된 균주를 3% 농도로 접종하 여 각 온도 조건에서 배양하였다. 온도 조건은 20°C, 30°C, 40°C, 50°C로 조절 하였다. 배양 시간에 따른 균 체의 성장은 시간마다 배양액 1mL를 채취하여 자외 선 흡광광도기를 이용하여 600 nm에서 optical density 를 측정하였다.
2.5 축산악취 저감효율 평가
선별된 균주의 축산악취 저감성능 평가를 위해 Fig. 1과 같이 Lab Test용 acrylbox를 높이 50 cm, 가로 45 cm, 세로 45 cm로 제작하여 외부공기를 차단하고 내부 용기에 악취발생시료를 각각 1,000 mL, 990 mL, 950 mL, 900 mL 씩 주입한 후 아무것도 첨가하지 않은 대 조군과 strain YUN4 균주 배양액(Y4)을 각각 1% (10 mL), 5% (50 mL), 10% (100 mL)를 혼합한 시험군을 30분간 폭기 후 폭기가 지속된 상태에서 악취시료를 채취하여 암모니아와 황화수소 저감효율을 평가하였다. 암모니아 농도는 ‘암모니아-붕산용액-흡광광도법’으로 분석하였으며, 황화수소 분석은 ‘황화합물-저온농축-모 세분리관-기체크로마토그래피법’을 이용하였다(NIER, 2019). 축산악취 저감효율 평가는 2019년 5월 14일부 터 5월 24일까지 동일한 방법으로 1~3일 간격으로 총 5회 실시하였다. 악취시료는 비육돈 4천 두를 사육하고 있는 전남 N시 H농장의 슬러리피트로부터 멸균 비이 커를 이용하여 약 5 L씩 채취한 후, 보냉용기를 이용 하여 실험실로 운반한 후 Autoclave에서 121°C, 15 psi 조건으로 20분간 고압멸균 하였으며, Y4는 starch· casein배지를 이용하여 25°C 배양기에서 5일간 배양하 여 균주밀도가 약 108 정도가 되도록 하였다.
또한, 암모니아와 황화수소 외에도 분뇨에 함유된 악취성분에 대한 저감효율을 평가하기 위해 실험 기간 중 2회에 걸쳐서 복합악취와 트리메틸아민에 대한 평 가를 실시하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 황화합물 및 암모니아 분해능 평가
순수분리 과정을 통해 10여 종의 단일 colony를 선 별한 후 각각 3회 이상 계대배양하고 황화합물과 암모 니아화합물 배지를 이용하여 분해능을 평가한 결과 Fig. 2와 같이 각각의 두 화합물 배지에서 공통적으로 colony를 형성하는 균주를 발견하여 strain YUN4로 명 명하였다. Strain YUN4는 암모니아화합물 배지에서는 접종 전 지점에서 colony를 형성하면서 원활하게 성장 한 반면, 황화합물 배지에서는 2 지점에서만 colony를 형성하였지만, 군집밀도가 높은 colony를 형성하여 황 화합물을 기질로 성장하는 것으로 알 수 있었다.
3.2 균주 동정
황화합물과 암모니아화합물을 공통적으로 기질로 이 용하는 strain Yun4의 16S rRNA 유전자 DNA sequence 분석결과 Streptomyces fulvissimus와 100% 동일한 유전 적 상동성을 가지는 것으로 나타났다(Score 1,480 bits).
Streptomyces fulvissimus는 Streptomyces 속에 속하는 방선균의 일종으로 주로 토양과 부패된 초목류에서 발 견되며, Valinomycin과 같은 항생물질을 생산한다 (Myronovskyi et al., 2013). Valinomycin은 Candida albicans와 Cryptoccccus albidus 같은 진균류에 대해 강한 항진균 활성을 보여(Makarasen et. al., 2018) 악 취저감 목적으로 사용 시 돼지의 폐사율을 낮추고 생 리활성을 증진시키는 효과도 낼 수 있을 것으로 기대 된다.
3.3 최적 pH 및 최적온도 평가
최적 생장 pH와 온도를 조사한 결과 Fig. 4, 5와 같 이 pH 5, pH 7, pH 9에서는 원할한 성장을 보인 반면, pH 3과 pH 11에서는 성장하지 못해 강산과 강알칼리 조건에서는 배양할 수 없음을 보였다. 또한, 30°C와 40°C에서는 원할한 성장곡선을 그리는 반면 50°C 이상 에서는 전혀 성장하지 못했으며, 20°C에서는 다소 지 연된 성장곡선을 그려 YUN4는 중온성 미생물의 생장 특성을 보였다.
3.4 축산악취 저감효율 평가
Strain Yun4 균주 배양액(Y4)의 악취물질 저감능력 을 평가하기 위해 돈사 슬러리피트 분뇨 원액에 Y4를 각각 1%, 5%, 10% 혼합한 시료와 Y4를 혼합하지 않 은 원액을 30분간 폭기 시킨 후 암모니아 농도와 황화 수소 농도를 분석하여 비교하였다(Table 2, 3). 그 결과 원액의 암모니아 농도는 60.1~127.2 ppm (ave. 85.1 ppm)으로 나타났으며, Y4를 1%, 5%, 10% 혼합한 시 료의 암모니아 농도는 각각 9.4~25.9 ppm (ave. 14.9 ppm), 1.8~15.7 ppm (ave. 9.3 ppm), 1.5~10.0 ppm (ave. 5.1 ppm)으로 나타나 암모니아 저감효율은 73.1~97.5% 를 보였다.
한편, 동일한 실험에서 황화수소 농도는 0.98~3.44 ppm (ave. 2.49 ppm)으로 나타났으며, Y4를 1%, 5%, 10% 혼합한 시료의 황화수소 농도는 각각 0.11~0.32 ppm (ave. 0.25 ppm), 0.11~0.26 ppm (ave. 0.12 ppm), 0.05~0.17 ppm (ave. 0.07 ppm)으로 나타나 황화수소 저감효율은 78.5~97.9%를 보였다.
또한, Y4의 혼합 농도가 1%, 5%, 10%로 높아질수 록 악취저감 효율 또한 높아지는 것으로 나타나 암모 니아 저감효율은 각각 82.4%, 89.5%, 93.9%, 황화수소 저감효율은 각각 88.7%, 91.9%, 94.9%로 나타났다 (data not shown). 또한, 암모니아와 황화수소 외에도 축산분뇨에는 다양한 성분의 악취물질이 포함되어 있 을 것으로 판단되며, 본 연구에서는 그 중 트리메틸아 민과 복합악취에 대한 저감효율 평가를 실시하였다. 그 결과 트리메틸아민은 모든 시료에서 불검출 되었으며, 복합악취는 대조군과 Y4를 1%, 5%, 10% 혼합한 시료 에서 각각 4,481~6,694 배수, 669~2,080 배수, 669~ 1,442 배수, 1,000~1,442 배수로 나타나 대조군 대비 4~6 배 이상 낮아지는 것으로 나타났다(data not shown). 따라서 미생물 배양액의 농도와 살포량을 높 일수록 악취저감 효과는 높아질 것으로 추측되지만, 미 생물 배양의 경제성과 살포비용을 감안한다면 분뇨발 생량의 5% 이내에서도 원하는 효과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 연구에서는 악취시료 원액 과 미생물배양액의 접촉시간을 30분으로 비교적 짧게 유지하였지만, 축사 살포 시 살포된 미생물이 분뇨와 혼합되어 장기간 체류하면서 암모니아와 황화합물을 기질로 증식된다면 악취저감 효율은 상승할 것으로 기 대된다.
4. 결 론
돈사를 중심으로 한 축산악취는 심각한 사회적 갈등 을 유발하는 민원의 대상이지만, 적절한 해결방법이 없 어 지자체와 양돈농가의 골칫거리가 되고 있다. 본 연 구에서는 악취 저감능력이 우수한 미생물을 자연계에 서 분리하여 축사에 살포하는 친환경적인 돈사 악취제 거방안의 기초연구를 수행하고자 순천만 갯벌에서 미 생물을 분리하여 동정하고 배양특성을 파악하였으며, 황화합물과 암모니아 화합물을 대상으로 악취물질 분 해능을 평가하였다.
그 결과 순천만 갯벌에서 분리한 균주 중 암모니아 화합물과 황화합물을 기질로 성장할 수 있는 strain YUN4는 항진균 활성을 가지는 Streptomyces fulvissimus 로 판명되었으며, 20~40°C에서 성장하는 중온성 미생 물로, pH 5~pH 9 범위에서 원할한 생장곡선을 그렸다.
또한, 악취 저감 능력을 평가하기 위해 악취 발생시 료에 strain YUN4 배양액을 1%, 5%, 10%로 희석하고 30분간 접촉한 후 악취저감 효율을 평가한 결과 암모 니아는 82.4~93.9% 저감효율을 보였으며, 황화수소는 88.7~94.9% 저감되었다.
본 연구에서는 미생물과 악취원의 접촉시간을 짧게 유지시켜 악취저감 효율이 기대치보다 높지 않았을 것 으로 판단된다. 하지만 악취 분해능을 가지는 미생물의 지속적인 살포시 축사 내에 장기간 체류하면서 자체 증식되는 경우 악취 저감 효율은 상승할 것으로 기대 되며, Streptomyces fulvissimus와 같은 항진균 활성 박 테리아는 가축의 병원성 폐사율을 낮추고 화학약품 내 성을 완화하는 친환경 악취저감 미생물제제로서 가능 성을 보인 점에서 시사점이 있다고 할 수 있겠다.
