1. 서 론
버섯을 재배하는 시설인 재배사의 실내 환경은 일반 사람들이 다수 이용하는 다중이용시설과 달리 많은 사람이 이용하는 시설은 아니다. 그러나 산업적으로 농업에 종사하는 재배자들이 이용하는 시설로서 버섯의 생육특성상 다습하고 봄철부터 가을철까지 실내온도가 외부의 기온에 영향을 받아 변동하는 특성을 지니고 있다. 버섯의 종류에 따라 이러한 환경 조건에 다소 차이는 있지만 버섯 재배사는 공통적으로 습하고 다소 무덥고, 간접조명으로 어두운 특수 환경을 지니고 있다. 이러한 재배시설에서 식용으로 재배되는 버섯은 톱밥, 미강 등에 여러가지 농업부산물 을 첨가하여 제조한 배지를 이용하여 주로 재배되고 있다(Lee et al., 2018). 특히 곰팡이인 버섯균이 자라는데 필요한 배지는 유기물 함량이 많아서 세균이 번식하기도 쉬운 기질이다. 이러한 습도가 높고 유기질 양분이 많은 환경에서는 환기가 불충분할 경우 세균이 잘 증식하게 된다. 버섯의 생육을 위해 자주 물주기를 하면서 세균은 공기중으로 부유하여 바이오에어로졸로 존재하기 쉽다. 부유세균을 포함하여 바이오 에어로졸은 재배자에게 알러지, 전염성 질환 등 유발 시킬 가능성을 지니고 있다(Siersted and Gravesen, 1993;Dales et al., 1991;Ren et al., 1999). 부유세균은 어린이와 노약자, 면역이 약한 사람의 건강에 영향을 줄 수 있어서 환경부의 실내공기질관리법에서는 다중이용시설 중 의료시설, 노인요양시설, 산후조리원, 어린이집 등에 대해서 부유세균의 유지기준을 800 CFU/ m3로 정하고 있다. 따라서 버섯 재배사내의 환경위생으로서 공기 중 세균의 오염도와 종 다양성에 대한 정보는 재배사 관리와 식품 안전, 그리고 재배자의 건강을 위해서 중요하다.
국내의 기후는 지구온난화로 인하여 점차 아열대성 기후가 나타나고 있다(Park et al., 2020). 기후변화는 생물의 생존 환경에 영향을 미처 생물다양성에 영향을 주고 특정 종의 경우는 멸종위기 이르고 있다. 특히 새로운 종과 변종의 출현으로 신종병해가 발생하기도 한다(Martins et al., 2020). 버섯재배사의 경우도 이러한 기후변화로 인한 재배사내에 변화가 예측 되지만 기후변화 관점에서 아직 아무런 조사분석이 이루어지지 않은 실정이다. 이러한 조사분석을 위해서는 재배사내에 존재하는 세균에 대한 기초정보가 필요하다. 이에 따라 본 연구팀은 재배사내 환경에서 미생물상의 변화가 어떻게 이루어지는지에 관심을 가지기 시작하였고 이에 따라 몇 년 전부터 재배사내의 부유세균의 농도와 종의 다양성 실태 조사하여 왔다(Kim, et al., 2014;Ahn al., 2017). 더불어 세균을 퍼트리는 파리류에 대한 조사도 수행하였다(Kwon, et al., 2016). 본 연구에서는 국내 서로 다른 지역에 위치하고 있는 표고 재배사를 근간으로 부유세균 농도와 종 분석을 수행하여 같은 재배사내에서 2년간 세균상의 변화가 있는지 비교하고 나아가 몇 년 전 조사된 세균상과 비교함으로서 재배사내의 부유세균 다양성 변화에 대한 기초정보를 마련하고자 하였다.
2. 재료 및 방법
2.1 조사 지역 및 기간
2년간 조사를 수행하였다. 1차년은 2020년 4월부터 2020년 9월사이 2차년은 2021년 4월부터 10월 사이에 조사를 실시하였다. 버섯 재배사는 표고 재배사를 대상으로 실시하였다. 이는 지난 몇 년간 조사된 자료가 표고 재배사를 대상으로 보고되었기에 같은 재배 목적에 사용되는 시설을 조사 비교를 하는데 지속성을 꾀하고자 하였다. 1차년도에는 충청남도의 아산, 청양, 충청북도 청주, 경상북도 청도, 전라남도 장흥, 경기도 여주 지역 소재 7개 농장의 재배사를 대상으로 조사하였다(Table 1). 2차년도에는 충청남도의 아산, 청양, 충청북도 청주, 경상북도 청도, 전라남도 장흥, 경기도 여주 지역 소재 7개 농장의 재배사를 대상으로 조사하였다(Table 1). 2차년도에는 청주와 여주 의 재배사 한곳을 제외하고는 같은 지역 같은 농장의 재배사에서 조사를 수행하였다(Table2). 환경기록 측정을 위해서 Tinytag 데이터로거를(TV-4500, UK)를 버섯 재배사의 가운데 지점에 설치하고 1시간마다 온도와 습도를 측정하였다. 측정된 자료에서 최저·최고 온도와 최저·최고 습도를 매달 평균을 기록하고 자료를 제시하였다. 조사 대상 재배사는 원목에 버섯을 재배하는 재배사(Log-bed)와 톱밥 배지에 버섯을 재배하는 재배사(Sawdust-based)였다. 일반적으로 톱밥 배지에 버섯을 재배하는 재배사는 온습도 조절과 더불어 환기장치 등이 잘 제어되는 환경이다.
2.2 시료 채집 방법 및 세균 동정
재배사내 공기중 부유세균 측정은 재배사 마다 2개 동에 대해 3차례 반목으로 공기시료 채집을 수행하 다. 공기채집은 환경부 실내공기질공정시험방법에 따라 충돌법을 수행하였다. Andersen sampler를(Single Stage Ambient Viable Sampler, Model 10-880, Tisch Environmental, Cleves, OH, USA) 사용하여 28.3 L/ min 유량으로 1분간 공기를 채집하였다. 측정 위치는 버섯 재배사 동마다 중앙지점에서 위치하여 높이 1.3 m 높이에서 수평을 맞추어 측정하였다(Ahn et al., 2017). 세균 포집 배양배지로서는 TSA (Tryptone Soya Agar, Oxoid, UK)에 항진균제 benomyl (100 ppm 농도로 첨가하여 사용하였다. 채집된 공기중 포집 세균 시료는 파라필름으로 봉하고 쿨러에 담아 실험실로 가져와 25°C 배양기에서 3일간 배양하였다. 배지에 자라난 세균 콜로니 수를 계수하여 유량을 계산하여 부유세균 농도를 계산하였다. 세균 종 분석을 위해서는 배지에 자란 콜로니의 색, 모양, 번지는 형태 등을 관찰하여 서로 다르게 보이는 colony를 선택하여 새로운 TSA 배지에 계대배양을 통해 순수분리하였다. 순수분리된 세균들은 앞서 보고된 방법(Ahn et al., 2017;Kim et al., 2014)과 동일한 방법으로 분자동정을 위하여 16S rDNA를 분석하였다. 대상 DNA를 증폭하기 위하여 universal primer인 27F와 1492R (Lane, 1991)을 사용 하였고 template DNA는 배양된 세균의 colony PCR (polymerase chain reaction)을 통하여 얻어서 증폭에 바로 이용하였다. PCR 조건은 세균의 일반적인 16S rDNA 증폭조건을 이용하였고 PCR product는 1% agarose gel 전기영동을 실시하여 확인하였다. 증폭된 PCR product 는 나비바이오텍의 purification kit를 사용하여 정제 하였다. 염기서열분석은 Macrogen사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 분석된 유전자 염기서열은 http:/ /www.ezbiocloud.net/에서 데이터베이스에 존재하는 Type species의 16S rDNA 염기서열과 상동성 분석을 수행하고 동정하였다. 계통분류학적 분석을 위해서는 MEGA-X program (Kumar et al., 2018)을 사용하여 neighbor-joining 방법(Saitou and Nei, 1987)으로 분석 하였고 계통도 가지의 clade 신뢰도는 1000번의 bootstrap resampling을 수행하여 평가하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 재배사내 온도와 습도
2020년 1차 조사기간 버섯 재배사내 온도와 습도를 측정한 결과 최고 온도는 여주 A 재배사에서 29.3°C 였고 최저 온도는 청주 재배사에서 16°C였다(Table 1). 온도 편차는 7개 재배사 모두 1°C 이내로서 측정치의 온도조사 편차는 매우 양호하였다. 재배사간의 온도 차이는 4월에서 9월간 조사한 시점이 재배사마다 다르기 때문에 나타난 결과이다. 즉 초봄에 조사한 곳 에서 가장 낮게 나타났다. 가장 높게 측정된 여주A 재배사의 경우 여름철 기온이 높을 때 조사하였기에 다른 재배사보다 높게 조사되었다. 흥미롭게도 이곳 온도가 높으면서 습도는 28.8%로 가장 낮았다. 습도의 경우 가장 높은 곳은 87.3%의 청주 소재 재배사였다. 습도 편차는 온도 편차에 비해 다소 3개 재배사 시설에서 1% 범위를 초과하여 존재하였다.
2021년 2차 조사기간 버섯 재배사 내 온도와 습도를 측정한 결과 최고 온도는 27.3°C로서 1차년도와 마찬가지로 여주 A 재배사에서 가장 높았다. 최저 온도는 1차년도에 가장 낮은 온도를 보였던 청주 재배사가 2차년도에는 재배를 하지 않음으로서 비교를 할 수 없었다. 조사된 재배사 가운데에서는 가장 최저 온도는 아산의 재배사에서 20.6°C였다(Table 2). 온도 편차 역시 6개 재배사 모두 1°C 이내로서 측정치의 온도조사 편차는 1차년도처럼 매우 양호하였다. 2차년도 역시 재배사간의 온도 차이는 4월에서 9월간 조사 한 시점이 재배사마다 다르기 때문에 나타난 결과로 사료된다. 가장 높게 측정된 여주A 재배사의 경우 역시 여름철 기온이 높을 때 조사하였기에 다른 재배사 보다 높게 조사되었다. 습도의 경우 가장 높은 곳은 82.3%의 청도 소재 재배사였고 가장 낮은 곳은 49.3%의 장흥 소재 재배사였다. 습도 편차는 조사된 모든 재배사 시설에서 1% 범위 이내로 존재하였다. 1차년도와 2차년도 조사된 평균 온도와 습도 자료로 볼 때 4월부터 9월간 재배사내 온습도 환경은 세균이 번식하는데 무리가 없는 조건에 있음을 알 수 있다. 재배사 시설 외기의 온도가 높거나 낮은 시즌에 따라 재배사 내부의 온도가 높거나 낮은 성향이 있는 것이 관찰되었다. 따라서 향후 외기와 내기의 온습도 차이가 얼마나 나는지 지속적인 조사가 요구된다.
3.2 재배사내 부유세균의 농도
재배사내 공기중 부유세균의 농도는 1차년 조사의 경우 가장 높은 농도는 2.5 × 103CFU/m3로서 청도 소재 재배사였고 가장 낮은 농도는 3.7 × 102CFU/m3로서 여주B 재배사였다. 환경부 기준치 800 CFU/m3로 볼 때 장흥과 여주B 재배사를 제외하고는 5개 다른 재배사에서 모두 기준을 초과하였다. 초과 수준은 여주 A와 청주에서 200 CFU/m3 정도 초과하였고 아산, 청도, 청주 소재 재배사의 경우 약 2.5 ~ 3배 수준으로 초과하였다.
2차년 조사의 경우 가장 높은 농도는 1.8 × 103 CFU/ m3로서 청양 소재 재배사였고 가장 낮은 농도는 8.1 × 10 CFU/m3로서 아산과 장흥 소재 재배사였다. 청도와 청양 소재 재배사는 1차년도 조사 때 뿐만아니라 2차년도 조사 때에도 환경부 유지기준치 800 CFU/m3를 초 과하였다. 전체적으로 5개 재배사 중 이들 2개 재배사만 기준을 초과하였다. 초과수준은 1차년도 보다는 줄 어든 수준이었다. 2년간 조사된 자료를 볼 때 재배사 내 실내공기중 부유세균수가 지속적으로 환경부 기준치를 초과하는 재배사가 있음을 볼 수 있었다. 부유세균수는 공기중에 부유하는 미세먼지와도 결합하여 존재할 수 있으므로 부유세균의 농도가 변동하는 원인을 규명하는 자료를 도출하고자 한다면 미세먼지 조사도 병행 수행하여야할 것으로 사료된다.
3.3 세균 동정
Table 1에 제시된 부유세균 측정을 수행하면서 배지에 포집되어 자라난 세균 콜로니를 순수분리하여 배양한 모습은 Fig. 1과 같다. 흰색, 노란색, 베이지색, 옅은 주황색 계통의 콜로니 색상을 보였다. 이들 순수분리된 세균을 종 수준으로 동정한 결과는 Table 3 과 같다. 20속 32종에 속하는 균이 동정되었다. 이중 가장 많이 검출된 종은 Bacillus 속에 속하는 종이었다. 분리된 종간의 계통학적 분석 결과는 Fig. 2와 같다. Basilli 에 주로 속하는 종들이 많았고 그 다음으로 Actinobacteria에 속하는 종들이 많았다. 나머지는 종 들은 α-proteobacteria, β-proteobacteria, γ-proteobacteria 그룹에 속하였다.
Table 2에 제시된 부유세균 측정을 수행하면서 배지에 포집되어 자라난 세균 콜로니를 순수분리하여 배양한 모습은 Fig. 3과 같다. 흰색, 노란색, 베이지색, 옅은 주황색, 붉은색 계통의 콜로니 색상을 보였다. 이들 순수분리된 세균을 종 수준으로 동정한 결과는 Table 4와 같다. 22속 29종에 속하는 균이 동정되었다. 이중 가장 많이 검출된 종은 Bacillus 속에 속하는 종이었다. 분리된 종간의 계통학적 분석 결과는 Fig. 4와 같다. Basilli 에 주로 속하는 종들이 많았고 그 다음으로 Actinobacteria에 속하는 종들이 많았다. 나머지는 종 들은 α-proteobacteria, β-proteobacteria, γ-proteobacteria 그룹에 속하였다. 이런 계통도 분석의 결과는 비록 종 수준에서는 상이하였지만 class 수준의 분류군에서는 그 성향이 유사하였다. 흥미롭게도 1차년도 와 2차년도 동정된 세균 종 중에서 공통으로 계속해서 분리된 종은 Bacillus altitudinis, Brevibacterium frigoritolerans, Staphylococcus epidermidis 등 3종에 불과하였다. 이는 동일한 재배사라고 하더라도 해가 바뀌면서 부유하는 세균의 종류도 매우 달라진다는 것을 보여주는 결과이다. 또한 10년 전 Kim et al. (2014) 이 표고 재배사에서 동정한 부유세균 종 분석 자료와 비교해 볼 때 Bacillus aryabhattai 1속 1종만이 겹치며 그 외의 33속 57종은 겹치지 않았다. 또한 5년 전 Ahn et al. (2017)이 표고 재배사에서 동정한 부유세균 종 분석 자료와 비교해 볼 때 Bacillus toyonensis, Bacillus velezensis, Flavobacterium acidificum, Lysinibacillus fusiformis, Paenibacillus taichungensis, Pseudomonas palleroniana, Staphylococcus equorum, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus succinus, Streptomyces badius 등 7속 10종이 겹치고 그 외의 31속 46종은 겹치지 않았다. 재배사 위생에 관여하는 표고 재배사 내 파리류로부터 세균을 분리 동정한 Kwon et al. (2016) 의 자료와 비교했을 때에도 Lysinibacillus fusiformis, Paenibacillus taichungensis 등 2속 2종이 겹치고 그 외 의 32속 56종은 겹치지 않았다. 이상의 결과로 보면 재배사 내의 부유세균상이 해마다 크게 변동하고 있음을 알 수 있었다. 지금까지 이렇게 장기간동안 특정 시설을 대상으로 부유세균을 조사 비교한 연구가 없는바 본 연구 결과는 매우 귀중한 정보를 제공한다. 이러한 변동 요인이 어떠한 연유로 생겨나는지는 아직 모르기 때문에 추후 장기적인 모니터링을 통한 규명이 필요하다.
3.4 동정 세균의 인체 위해성 관련 보고 자료 조사
1차년도와 2차년도에 동정된 세균의 알려진 인체 위해성 관련 자료를 조사해본 결과 1차년도 8종, 2차년도 7종 등이 관련 있는 것으로 조사되었다(Table 3, 4). 인체유해성 내용을 살펴보면 균혈증(Bacteremia)을 일으키는 Brevundimonas vesicularis, Dermacoccus nishinomiyaensis, Staphylococcus equorum, Delftia acidovorans을 비롯하여 복막염((Peritonitis) 원인균 Dermacoccus nishinomiyaensis, 패혈성 쇼크(Septic shock) 원인균 Micrococcus luteus, 결막염(Conjunctivitis)을 일으키는 Moraxella osloensis, 피부병(Skin disease) 원인균 Roseomonas mucosa, 심내막염 (Endocarditis) 유발균 Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus, 요로감염(Urinary tract infection)균 Staphylococcus saprophyticus, 식중독(Food poisoning) 균 Bacillus cereus, 브루셀라증(Brucellosis) 유발균 Brucella haematophila, 폐렴(Pneumonia) 유발균 Klebsiella pneumoniae, 뇌수막염(Meningitis) 유발균 Pseudomonas oryzihabitans, 경화성 부종(Sclerosing edema) 유발균 Pseudarthrobacter scleromae 그리고 장염(enterocolitis) 을 일으키는 Staphylococcus saprophyticus 등이 조사되었다.
4. 결 론
본 연구는 2020년 ~ 2021년간 국내 6개 지역에 소재 한 버섯 재배사로부터 실내의 온도와 습도, 부유세균 농도를 측정하고 부유세균을 분리 동정을 하였다. 조사된 자료는 1차년도와 2차년도 결과를 비교하였다. 1차년도와 2차년도 조사된 평균 온도와 습도 자료로 볼 때 4월부터 9월간 재배사내 온습도 환경은 세균이 번식하는데 무리가 없는 조건에 있음을 알 수 있다. 재배사 시설 외기의 온도가 높거나 낮은 시즌에 따라 재배사 내부의 온도가 높거나 낮은 성향이 있는 것이 관찰되었다. 전체적으로 5개 재배사 중 이들 2개 재배사만 기준을 초과하였다. 초과수준은 1차년도 보다는 줄어든 수준이었다. 2년간 조사된 자료를 볼 때 재배 사내 실내공기중 부유세균수가 지속적으로 환경부 기준치를 초과하는 재배사가 있음을 볼 수 있었다. 1차년도 조사에서는 20속 32종, 2차년도 조사에서는 22 속 29종에 속하는 균이 동정되었다. 이중 가장 많이 검출된 종은 모두 Bacillus 속에 속하는 종이었다. 공통 으로 계속해서 분리된 종은 Bacillus altitudinis, Brevibacterium frigoritolerans, Staphylococcus epidermidis 등 3종에 불과하였다. 이는 동일한 재배사라고 하더라도 해가 바뀌면서 부유하는 세균의 종류도 매우 달라진다는 것을 보여주는 결과이다. 동정된 종 중에서 인체위해성이 알려진 종은 1차년도에 8종 2차년도에 7종 이었다. 유해성으로는 균혈증, 복막염, 패혈성 쇼크, 결막염, 피부감염, 심내막염, 요로감염, 식중독, 브루셀라증, 폐렴, 뇌수막염, 경화성 부종, 장염 등이 조사되었다. 본 연구 결과는 재배사 환경 관리를 위한 중요한 정보를 제공한다.
