1.서 론

국가기록원은 보존가치를 지닌 기록물과 국가적으 로 중요한 민간 및 해외 소재 기록물을 수집, 보관하 는 기관이다. 전국에서 세 곳의 국가기록원이 존재하 며, 성남에 나라기록관, 대전에 행정기록관 및 본원, 부산에 역사기록관이 있다. 이 중 성남에 위치한 나 라기록관은 2007년에 설립되어 지하 3층에서 지상 7 층 규모와 서고동, 사무동, 전시·열람동 4개의 동으로 구성되어 있으며, 대한민국의 국무회의록을 비롯하 여 약 680만권의 기록물을 보존하고 있다. 이 기록물 중에는 100년 이상 보존하고 있는 고서나 발견당시부 터 손상되어 있던 기록물도 존재한다.

국가기록원의 기록물 중 비전자기록물의 대부분은 종이류이며, 그 비중은 2019년말 기준으로 전체 기록 물의 68.1%를 차지하고 있다. 종이는 셀룰로오스, 헤 미셀룰로오스, 리그닌과 같은 식물성 요소로 이루어 져 있는데 물리적, 광학적, 화학적, 생물학적 요인에 의해 손상될 수 있다(Park et al., 2014). 이 요인들에 속 하는 것으로는 온도, 습도, 공기중 성분(황산화물, 질 소산화물, 오존, 먼지), 빛, 미생물 등이 있다. 최근 조 사에 의하면 이 중 국가기록원 서고 내의 온도와 습 도는 국가기록원 관리 규정의 온도(18°C~22°C)와 습 도(40%~55%)를 벗어나지 않게 유지 관리되고 있었고 공기중 오염물질 또한 국내법상의 기준치를 초과하 지 않는 것으로 나타났다(Kim et al., 2014). 그렇기 때 문에 종이가 손상되는 주 위험 요인으로 미생물이 지 적되고 있다. 종이에서 증식한 미생물은 종이 성분을 양분으로 이용하고, 대사를 하면서 분비물을 내어 기 록물의 변색을 야기하고, 결국 종이의 훼손을 초래하 게 된다(Noh et al., 2021).

미생물 중 진균은 세균보다 종이의 주요 구성물질 인 셀룰로오스 분해 능력이 뛰어나고, 변색을 일으키 는 색소형성 능력도 탁월하다. 또한 포자를 형성하여 공기중으로 이동이 쉽고, 열악한 환경에서도 버틸 수 있기 때문에 기록물에 아주 치명적인 손상을 일으킬 수 있다(Drougka et al., 2020). 진균의 포자는 작아서 눈으로 관찰할 수 없기 때문에 제어가 어려우며, 공 기중에 존재하는 포자는 기록물뿐만 아니라 인체에 도 영향을 줄 수 있다. 현재 국가기록원은 기록물의 전시, 열람, 문화행사, 체험학습 등 문화공간으로도 쓰 이기 때문에 인체에 유해한 진균이 증식한다면 이용 자의 건강에 큰 영향을 줄 수도 있다(Maggi et al., 2000). 따라서 미생물에 의한 기록물의 생물학적 손 상이나 건강에 유해가 생기지 않도록 하기 위해서는 국가기록원 서고내에 공기중 부유미생물에 대한 관 리가 필요하다. 최근 국가기록원 서고의 실내에서 부 유진균 농도 및 일부 종에 대한 보고가 있었다(Kim et al., 2018). 그 후 좀 더 확대된 시설에서 국가기록원 서 고의 부유진균 농도에 대한 조사가 수행되었다(Noh et al., 2021). 이 보고에서 향후 국가기록원의 시설내 진균 관리를 위해서는 공기중 부유하는 진균의 종 분 석 연구 수행의 필요성이 제시되었다. 그러나 정확한 종에 대한 정보는 아직 매우 미진한 실정이다. 본 연 구진은 국가기록원에서 채집한 진균 시료에 대해 확 대된 종분석을 수행해 오고 있는데 그 와중에 국내에 보고되지 않은 새로운 진균 종을 5종 발견하였다. 이 에 따라 본 연구에서는 국내 미기록종인 5종의 진균 에 대한 형태적 특성 및 분자생물학적 분석을 통해 동 정 결과를 보고하고자 한다.

2. 재료 및 방법

본 연구는 2019년 5월부터 2020년 9월까지 국가기 록원 나라기록관 내에 있는 서고 중 지하1층, 지상1 층, 2층, 5층, 6층에 있는 서고에서 공기중으로부터 진 균을 분리하여 조사하였다. 진균 분리는 Andersen sampler (KAS-110, Kemik Corporation)를 유량 28.3 L/min로 5분 가동하여 충돌법으로 진균을 포집하였 다(Fig. 1. A)(Ahn et al., 2017). 진균 포집은 서고내에 서 위치를 달리하여 3반복으로 진행하였다. 포집에 사 용한 배지는 DG18 (Dichloran 18% glycerol)이며, 진균 포집 후 25°C 배양기에서 3일 ~ 4일 정도 배양하였다 (Fig. 1. B). 배지에 자라난 진균 중 형태적으로 다른 균 들은 Potato Dextose Agar (PDA)배지에 순수 분리하였 다(Fig. 1. C). 순수 분리된 균은 광학현미경 관찰을 통 해 균사와 포자의 구조를 파악하였다.

DNA 염기서열 분석을 위해서는 배지에 자란 진균 의 균사를 수거하여 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit (바이오니아, 대전)로 genomic DNA를 추출한 후 Polymerase Chain Reaction (PCR) 반응을 위한 template DNA로 사용하였다. AccuPower® PCR PreMix & Master Mix (바이오니아, 대전)를 사용하여 PCR을 수행하고 바코드 지표로 사용되는 Internal transcribed spacer (ITS) rDNA 영역을 증폭하였다(Usyk et al., 2017). 진균 속에 따라 종 동정이 쉽지 않은 분류군에 대해서는 추가로 beta-tubulin (TUB)유전자(Glass and Donaldson, 1995), Calmodulin (CAL)유전자(O'Donnell et al., 2000) 영역을 증폭하였다. 증폭한 뒤에는 PCR 증 폭 산물을 AccuPrep® PCR/Gel Purification Kit 바이 오니아, 대전)를 이용하여 순화한 후 Macrogen사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열 분석을 수행하였다. 분 석된 염기서열을 가지고 NCBI DNA database (https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/)에서 BLAST 프로 그램을 이용하여 유사 염기서열 탐색을 수행 후 알려 진 진균 종의 DNA 염기서열 과의 유사도를 조사하였 다. MEGA-X 프로그램(Kumar et al., 2018)을 이용하여 ITS 영역의 염기서열과 LSU, TUB, CAL 영역의 염기 서열을 유합하여 분석한 후 계통수를 작성하여 종을 동정하였다. 미기록종으로 확인된 균의 생물표본은 국립생물자원관(NIBR)에 기탁하고 NIBRFGC 등록번 호를 부여받았다.

3. 결과 및 고찰

3.1 미소독 서고내 공기에서 분리된 진균의 동정

충돌법으로 조사된 진균의 농도는 이전 연구에서 보고하였다(Noh et al., 2021). Fig. 1. B에나타난것처럼 고체배지 상에 자라난 진균을 Fig. 1. C 처럼 순수분리 후 균총의 특징과 광학현미경상에서 관찰하였을 때 배지에 출현 빈도가 높은 균은 형태적으로 Cladosporium 속에 속하는 균들과 Penicillium속에 속하는 균들 이 었다. 이들 중에서 특징이 다르게 보이는 균총들을 임 의 선정하여 비교하였다. 동시에 DNA 분석을 실시하 여 추가적으로 비교하였다. 그 결과를 NCBI의 Blast 프로그램을 사용하여 진균의 DNA 데이터베이스상에 존재하는 알려진 진균의 염기서열과 유사도를 비교하 고 분자적 동정을 수행하였다. 그 결과 5종의 진균이 환경부의 국내자생종 목록에 수록된 진균종에 존재하 지 않는 종임을 확인하여 새로이 발견된 국내 미기록 종임을 확인하였다. 본 논문에서는 국가기록원 미기록 서고내에서 분리한 이들 5개 진균을 각각 DK14-22, DK14-23, DUCC17218, DUCC17704, DUCC16020 라 는 번호를 부여하고 형태적 특징(Fig. 2) 및 분자생물 학적 계통 분석결과를 서술하였다.

Cladosporium parahalotolerans (Bensch et al., 2018). DK14-22 균주를 PDA배지에서 7일간 배양하였 을 때 균총의 직경은 약 38 mm였으며 앞면은 어두운 녹색을 띠었고 뒷면의 가장자리는 얇은 흰색 띠를 형 성하고 중앙부분은 검은색을 나타내었다(Fig. 2. A, F). 분생포자를 현미경으로 관찰한 결과 쌀알처럼 타원 형 형태를 띠고 무색인 것을 관찰하였다. 분생포자의 크기는 약 4~6.5 × 2~3 μm이다(Fig. 2. K). ITS region 의 염기서열을 분석하여 분자생물학적 계통수를 작 성한 결과 DK14-22 균주는 Cladosporium parahalotolerans (MF473167)와 clade를 형성하였다(Fig. 3). 분자적으로 동정이 완료된 균은 문헌조사 후 미기록종으로 생체 시료를 국립생물자원관에 기탁하고 등록번호NIBRFGC 000505473을 부여받았다.

C. parahalotolerans는 2018년도 네덜란드의 아파트 에서 swab한 샘플에서 J. Houbraken에 의해 처음 보고 되었다(Bensch et al., 2018). 보고된 기재문에서 분생 포자는 구형 또는 난형이며 평균 6.4 × 4 μm의 크기로 관찰되었다. PDA배지에서 14일간 배양하였을 때 직 경은 약 20~40 mm에 이르고 올리브색 또는 올리브 회 색을 띤다고 기재되었다. 기재문에 기재된 균의 형태 학적 특성과 DK14-22 균주의 특성을 비교하였을 때 동일한 균주인 것을 확인하였다. 또한 인체유해성과 종이의 유해한 변색 가능성, 효소분비 능력을 조사했 지만 아직 보고된 것이 없었다.

Cladosporium subuliforme (Bensch et al., 2010). DK14-23 균주를 PDA배지에서 7일간 배양하였을 때 균총의 직경은 약 54 mm였으며 앞면은 연한 녹색을 띠고 균총에 직선으로 생긴 모양에 따라 배지가 갈라 진 것을 관찰하였다. 뒷면은 가장자리가 연한 노란색 을 띠고, 중앙 부분은 검은색을 띠었다(Fig. 2. B, G). 분 생포자를 현미경으로 관찰한 결과 쌀알처럼 타원형 이며 끝 부분이 뾰족하게 튀어나온 형태를 띠고 투명 한 녹색인 것을 관찰하였다. 분생포자의 크기는 약 5.5~7 × 2.5~3 μm이다(Fig. 2. L). ITS region의 염기서열을 분석 하여 분자생물학적 계통수를 작성한 결과 DK14-23 균 주는 type 균주주 Cladosporium subuliforme (MH864124) 와 clade를 형성하였다(Fig. 4). 분자적으로 동정이 완 료된 균은 문헌조사후 미기록종으로 파악된 진균의 생체시료를 국립생물자원관에 기탁하고 등록번호 NIBRFGC000505474를 부여 받았다.

C. subuliforme는 2010년 태국 Chamaedorea (야자나 무)에서 I. Hidayat와 J. Meeboon에 의해 처음 보고되 었다(Bensch et al., 2010). 보고된 기재문에서 분생포 자는 타원형이며 끝부분으로 갈수록 좁아지는 형태 를 띠며, 크기는 평균적으로 8.3 × 2.6 μm로 관찰되었 다. PDA배지에서 14일동안 배양하였을 때 직경이 약 80mm에 이르고, 앞면은 회색 빛 올리브색을 띄었다. 가장자리는 녹 회색을 띄고 약간 물결 모양이 나타났 다. 회색 빛 올리브색을 띠었다. 가장자리는 녹 회색 을 띠고 약간 물결 모양이 나타났다(Bensch et al., 2010). 원 기재문에 기재된 균의 형태학적 특성과 DK14- 23 균주의 특성을 비교하였을 때 동일한 균인 것을 확 인하였다. 인체유해성과 종이의 유해한 변색 가능성, 효소분비 능력을 조사했지만 아직 보고된 것이 없었다.

Ochroconis mirabilis (Samerpitak et al., 2013). DUCC17218 균주를 PDA배지에서 7일간 배양하였을 때 균총의 직경은 약 60 mm였으며 앞면은 전체적으 로 짙은 녹색을 띠었다. 균총의 중심에서부터 가장자 리로 갈수록 색이 짙어지는 것이 관찰되었다. 뒷면은 중심부가 연한 갈색이고 검정색을 띠었고 가장자리 는 짙은 갈색으로 나타났다(Fig. 2. C, H). 분생포자를 현미경으로 관찰한 결과 타원 모양의 형태를 띠고 투 명하였다. 분생포자의 크기는 약 4~5 × 3~4 μm이다(Fig. 2. M). ITS region의 염기서열을 분석하여 분자생물학 적 계통수를 작성한 결과 DUCC17218 균주는 Ochronocis mirabilis (MF475936)와 clade를 형성하였다(Fig. 5). 분 자적으로 동정이 완료된 균은 문헌조사후 미기록종 으로 생체시료를 국립생물자원관에 기탁하고 등록번 호 NIBRFGC000508313을 부여받았다.

O. mirabilis는 2013년 일본에서 물고기 일종인 Devil stinger에서 Samerpitak 와 de Hoog에 의해 보고되었다 (Samerpitak et al., 2014). 문헌조사 결과, 인체와 동물 에게 기회주의적 병원체이며(Shi et al., 2016), 변색 가 능성과 효소 분비 능력은 아직 알려지지 않았다.

Penicillium angulare (Peterson et al., 2004). DUCC 17704 균주를 PDA배지에서 7일간 배양하였을 때 균 총의 직경은 약 18 mm였으며 앞면은 연한 녹색과 노 란색을 띠고 가장자리는 흰색을 띠었다. 균총의 주변 은 짙은 보라색으로 물들은 것처럼 관찰되었다. 뒷면 은 짙은 보라색에 의해 연한 주황색으로 관찰되었다 (Fig. 2. D, I). 분생포자를 현미경으로 관찰한 결과 동 그란 모양의 형태를 띠고 투명하였다. 분생포자의 크 기는 약 3~4 × 1~2 μm이다(Fig. 2. N). ITS region의 염기서열과 TUB region의 염기서열을 유합으로 분석 하여 분자생물학적 계통수를 작성하였다. 그 결과 DUCC 17704 균주는 Penicillium angulare (KC773780)와 clade 를 형성하였다(Fig. 6). 분자적으로 동정이 완료된 균 은 문헌조사후 미기록종으로 생체시료를 국립생물자 원관에 기탁하고 등록번호 NIBRFGC00050 8331을 부여받았다.

P. angulare는 Peterson et al. (2004)이 북미의 썩은 나 무에서 분리하여 처음으로 보고하였다. 보고된 기재 문에서 분생포자는 구형으로 크기는 평균적으로 3.5 × 2.5 μm였다. CYA배지에서 7일간 배양하였을 때, 균 총의 직경은 약 13~18 mm에 이르고 전체적으로 황색 을 띠고, 연한 회청색의 포자색을 보이며 주름을 나 타났다. 기재문에 서술한 균의 형태학적 특성과 DUCC17704 균주의 특성을 비교하였을 때 동일한 균 인 것을 확인하였다. 또한 인체유해성과 변색 가능성 은 보고된 것이 없는 것을 확인하였고 효소분비 능력 을 조사했을 때 종이 성분 분해 효소인 cellulase를 가 지고 있었다.

Penicillium fundyense (Visagie et al., 2016). DUCC 16020 균주를 PDA배지에서 7일간 배양하였을 때 균 총의 직경은 약 27 mm였으며 앞면은 회색과 가장자 리는 노란색을 띠었다. 균총의 주변은 연한 노란색으 로 뒷면은 노란색으로 관찰되었다(Fig. 2. E, J). 분생 포자를 현미경으로 관찰한 결과 동그란 형태를 띠고 투명한 녹색이었다. 분생포자의 크기는 약 1~2 × 1~2 μm 이다(Fig. 2. Q). CAL 유전자의 염기서열과 TUB 유전 자의 염기서열을 분석하고 유합하여 분자생물학적 계통수를 작성하였다. 그 결과 DUCC16020 균주는 Penicillium fundyense (KT887814)와 clade를 형성하였 다(Fig. 7). 분자적으로 동정이 완료된 균은 문헌조사 후 미기록종으로 판단하여 생체시료를 국립생물자원 관에 기탁하고 등록번호 NIBRFGC000508321을 부여 받았다.

P. fundyense는 2016년 Visagie et al. 이 남아프리카 fynbos에서 분리하여 처음 보고하였다(Visagie et al., 2016). 보고된 기재문에서 분생포자는 구형을 띠며 매 끄러운 표면을 가졌다. 평균적인 크기는 2~3 × 2~3 μm 이다. MEA배지에서 7일간 배양하였을 때, 균총의 직 경은 약 22~24 mm에 이르고 전체적으로 회 녹색을 띠 며 벨벳 같은 질감을 나타냈다. 원 기재문에 서술된 균의 형태학적 특성과 DUCC16020 균주의 특성을 비 교하였을 때 동일한 균인 것을 확인하였다. 또한 인 체유해성과 종이의 유해한 변색 가능성, 효소분비 능 력을 조사했지만 아직 보고된 것이 없었다.

4. 결 론

곰팡이는 귀중한 종이 기록물을 분해하거나 변색 시켜 훼손하는데 중요한 미생물이다. 이에따라 국립 기록원의 기록물을 선진적으로 보존하기 위해서는 곰팡이 오염을 모니터링해야 한다. 최근 이러한 연유 로 곰팡이 오염 현황을 파악하고자 하는 노력의 일환 으로 국가기록원 미소독 기록물 보존서고의 실내공 기로부터 부유진균의 농도측정과 균 분리가 이루어 졌다(Noh et al., 2021). 그러나 진균 분석은 분류학적 연구가 동반되어야 좀 더 정확히 어떠한 진균이 문제 가 될 수 있는지 파악할 수 있다(Zielinska-Jankiewicz et al., 2008;Karbowska-Berent, et al., 2011). 그러나 조사 된 시설에 어떤 종들이 있는지에 대해서는 아직 보고 가 없는 바 본 연구에서 어떤 종들이 있는지 검토하 는 과정에서 3속 5종의 국내 미기록 종을 발견하였다. 발견된 5개 진균종은 Cladosporium parahalotolerans, Cladosporium subuliforme, Ochroconis mirabilis, Penicillium angulare, Penicillium fundyense이며 본 논문에 서는 이들 균주의 계통학적 위치에 대해 서술하였다. 이들은 형태학적 특성 및 rDNA의 내부 전사된 spacer 영역, 칼모듈린 유전자, 베타-튜불린 유전자 등을 중 합효소연쇄반응으로 증폭 후 증폭산물의 염기서열 분석을 기반으로 최종 동정되었다. 새로이 확인된 균 중에 Ochroconis mirabilis는 인체 및 동물에 기회감염 성 병원균이며 Penicillium angulare는 종이를 분해하 는 cellulase 활성이 있는 균이다. 본 연구 결과는 국가 기록원의 실내공기질 관리와 기록물 오염 관리 및 보 존에 문제가 되는 진균 종에 대한 새로운 정보를 제 공한다.