Journal Search Engine

to

Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citation Korean Bibliography PMC Previewer
ISSN : 2288-9167(Print)
ISSN : 2288-923X(Online)
Journal of Odor and Indoor Environment Vol.21 No.4 pp.324-335
DOI : https://doi.org/10.15250/joie.2022.21.4.324

Investigation of detection level by ATP bioluminescence assay for fire blight pathogen Erwinia amylovora monitoring in a laboratory environment

Ye In Kim, Jun Woo Cho, Min Yeong Kang, Seong Hwan Kim*
Department of Microbiology, Dankook University, Cheonan 31116, Korea
* Corresponding Author: Tel: +82-41-550-3454 E-mail: piceae@dankook.ac.kr
26/12/2022 29/12/2022 29/12/2022

Abstract


This study was conducted to obtain basic information for the use of the ATP fluorescence detection method in consideration of the most common and frequent contamination situation that occurs in laboratories dealing with fire blight causing bacterium, Erwinia amylovora. ATP luminescence measurements (Relative Light Unit, RLU) were tested against these pathogen cells (CFU/cm2) which were artificially introduced on the disinfected surface of a bench floor of a biosafety cabinet (Class 2 Type A1), on a part of the disinfected surface of a lab experimental bench, on a part of the disinfected floor, and on a part of the disinfected floor of an acryl chamber for bioaerosol studies in a biosafety laboratory (BSL 2 class) using two different ATP bioluminometers. RLU values were not much increased with the bacterial cells from 2.15 × 102/cm2 to 2.15 × 106/cm2. RLU values varied among the four different surfaces tested. RLU values measured from the same number of bacterial cells differed little between the two different ATP bioluminometers used for this study. RLU values obtained from bacterial cells higher than 2.15 × 107/cm2 indicated the presence of bacterial contamination on the four different surfaces tested. The R2 values obtained based on the correlation data for the RLU values in response to different E. amylovora cell numbers (CFU/ cm2) on the surfaces of the four test spots ranged from 0.9827 to 0.9999.


ATP bioluminometers , Biosafety laboratory , Erwinia amylovora , Relative light unit

연구실 환경에서 화상병균 모니터링을 위해 ATP 형광검출기의 검출범위 조사

김 예인, 조 준우, 강 민영, 김 성환*
단국대학교 생명과학부 미생물학전공

초록

    © Korean Society of Odor Research and Engineering & Korean Society for Indoor Environment. All rights reserved.

    1. 서 론

    Erwinia amylovora는 그람 음성균으로 막대 모양이 며 편모가 있어 운동성이 있는 세균이다. 이 세균은 사과, 배, 마르멜루, 블랙베리, 라즈베리 및 많은 야생 및 재배 장미과 식물에 화상병(fire blight)을 일으킨다 (Vanneste, 2000). 화상병은 산발적으로 발생하지만 때 때로 매우 파괴적이며 줄기나 대목을 침입하는 감염 으로 기주 식물을 완전히 죽일 수 있어서 특히 어린 과일나무에는 치명적인 병이다. 이 병은 19세기 뉴욕 시의 가까운 과수원에서 처음 보고된 이후 20세기에 는 유럽(Duffy et al., 2005;Lagonenko et al., 2008;Sletten et al., 2017), 아프리카 및 지중해 연안(El-Helaly et al., 1964;Fatmi et al., 2008;Shtienberg et al., 2015), 중앙아시아(Doolotkeldieva and Bobusheva, 2016;Drenova et al., 2013), 환태평양 연안 지역(Smits et al., 2014), 중국((Wang et al., 2021))까지 확산하여 매년 과수산업 에 막대한 경제적 손실을 입히고 있다(Khan et al., 2012). 이렇듯 E. amylovora는 현재 널리 퍼져 있고 피 해가 크기 때문에 식물에 피해를 주는 중요한 식물병 원세균 top 10에 올라 있다(Mansfield et al., 2012). 이 에 더하여 E. amylovora는 한번 유입되면 박멸하기 어 려운 병원체이기 때문에 병이 발생한 국가 또는 지역 으로부터의 기주식물체의 이동에 대해 여러 나라에 서 식물검역대상 균으로 지정하여 엄격한 관리를 요 구하고 있는 실정이다.

    우리나라에서도 수입 금지되는 고위험 병원체로 관 리되어 오고 있다. 그럼에도 불구하고 2015년 안성 소 재 배 과원과 제천 소재 사과 과원에서 처음 화상병 이 발견된 이후(Park et al., 2016), 매년 경기도와 충청 도를 중심으로 사과와 배 과원에서 병 발생이 늘어나 고 있으며 2020년 전라북도 익산, 2021년 경상북도 안 동을 포함한 전국 22개 지역으로 확산하였다(Lee et al., 2022). 급속한 확산을 방지하기 위해서 처음 발생한 지역의 경우 과원 전체의 기주식물을 제거하고 매몰 또는 소각처리 하도록 하여 왔다. 이 병의 방제를 위 해서는 감염식물체를 실험실로 가져와 병원균을 분 리하고 동정하는 작업 이외에도 병원체의 병원성 시 험, 유전 생리학적 시험 등이 요구되고 있으며 더 나 아가 방제 시험이 필요하다. 이 모두 실험실에서 병 원균을 다루어야 하는 과정이 요구된다. 그러나 현재 고위험 병원체로 취급되고 있지만 아직 국내에서 고 위험 식물병윈체의 연구를 위한 안전시설이 부재한 실정이다. 생물안전등급 2급 시설에서 여러 연구자에 의해 E. amylovora가 화상병 연구를 위해 취급되고 있 지만 아직 실험실 수준에서 안전관리를 위한 연구보 고는 거의 없는 실정이다. 이에 따라 예방 차원에서 연구실 안전관리를 위해 병원균을 다루면서 쉽게 오 염이 가능한 곳을 염두에 두고 병원균의 오염 여부나 정도를 인지할 수 있는지 모니터링 방법이 필요하다.

    고위험 병원체 연구시설에는 능률적인 세척 및 소 독 프로세스를 포함하여 강력한 환경 모니터링 프로 그램이 요구되고 있다. 그 일환으로 미생물 검출 방 법은 잠재적인 병원균이 없는 환경을 보장하기 위한 절대적인 요구 사항이다. 그러나 미생물 검출은 방법 에 따라 미생물을 배양하는데 시간이 오래 걸리는 과 정을 보통 포함하고 있다. 대안으로서 즉각적인 청결 정도를 측정하여 제공하는 새로운 기술이 개발되었 으며 그중 한 가지 방법은 Adenosine triphosphate (ATP) 형광검출분석법이다. 이 분석법은 보건위생 상 태를 점검하는데 널리 인정되어 많이 사용되는 방법 이다(Aycicek et al., 2006). 미생물 배양 배지를 활용하 는 배양법과 달리 누구나 쉽게 사용할 수 있고, 장비 를 가지고 다니며 현장에서 모니터링을 할 수 있다는 장점을 가지고 있다(Kim et al., 2010). 이 검사법은 세 균이 가진 ATP가 반응액에 들어 있는 Luciferin 및 Luciferase와 반응하여 발광하는 것을 생물발광단위 (Relative Light Units, RLU)로 측정하여 ATP 양을 표시 하는 것이다(Chen and Godwin, 2006).

    본 연구에서는 화상병균 감염 시료나 고위험 식물 병원균 취급 실험실에서 경우 가장 흔하게 또 빈번히 일어날 수 있는 오염 상황을 고려하여 ATP 형광검출 분석법의 활용을 위한 기초 정보를 얻고자 수행하였 다. 이를 위해서 운영기준실험구역 내 활동실험 종료 후 실험대 소독(또는 실험 중 오염 발생 시 즉시 소독) 시 소독효과 여부를 바로 파악하기 어려운 점, 식물 체에 병원균을 가위 접종 또는 분무 접종시 병원균 액 적이 실험대에 오염될 수 있다는 점, 또는 바닥에 액 적을 떨어뜨린 경우나 액적이 부유하다 바닥에 가라 앉을 수 있다는 점, 에어로졸 실험을 위해 챔버를 사 용시 챔버 내 바닥에 오염될 수 있다는 점 등을 고려 하여 화상병균 균수에 따른 ATP 형광검출기의 검출 정도를 조사하였다.

    2. 재료 및 방법

    2.1 세균 균주 및 배양

    본 연구의 모든 과정은 생물안전 2등급(BL2) 허가 를 받은 단국대학교 1과학관 생물안전실험실에서 수 행하였다. 실험수행에 대한 모든 과정은 식물방역법 에 기반한 고위험성 병원체의 취급에 대한 규정을 준 수하여 안전하게 수행하였다. 본 연구에 사용한 화상 병균 균주는 2021년 국내 과수화상병 발병 과원에서 분리 동정한 Erwinia amylovora 균주(DUCC1005)로서 -70°C 초저온 냉동고에 보존하고 있는 균주를 사용하 였다. PDA (BD DifcoTM, All for LAB, Seoul)에 일차로 획선으로 접종하여 28°C 배양기에서 2일간 배양하여 세균의 생존 활성을 확인한 후 멸균 접종 루프로 1개 의 콜로니를 따서 50mL Falcon tube에 담겨 있는 20 mL LB broth (BD DifcoTM, All for LAB, Seoul)에 접종하였다. 접종된 액체 배지는 28°C 회전배양기에 서 2일간 배양 후 Bench Top Centrifuge 를 이용하여 2,000 × g에서 원심분리하여 상등액은 버리고 침전된 균체를 수거하였다. 수거된 균체는 멸균한 0.1 mM PBS buffer (pH 7.0) 20 mL로 현탁 시킨 후 희석법을 이용 하여 PBS buffer로 serial dilution 한 후 각 희석액에서 100 μl 씩 취하여 PDA에 도말하였다. 도말한 PDA 배 지는 28°C 배양기에서 2일간 배양하여 자라나온 콜로 니를 계수하여 균의 농도를 계산하였다. 접종 실험을 위해 화상병균의 농도를 4.3 × 1011CFU/mL으로 조절 한 후 오염 시험에 사용하였다.

    2.2. 실험실 내 표면 오염 주기

    실험실에서 화상병 세균 분리, 배지 접종, 식물체 접 종, 에어로졸 분무 등의 작업 시 발생할 수 있는 곳으 로서 작업이 수행되는 생물안전작업대 표면(스테인 리스강 소재), 실험대 표면(목재 소재에 플라스틱 코 팅된 소재), 실험실 바닥면(모노륨의 플라스틱 코팅 소재), 에어로졸 실험 챔버(자외선등이 설치된 아크 릴 소재) 바닥면 등 4개 물체 표면을 오염 대상 선정 하였다. 표면 오염을 수행하기 위해서는 오염 대상 표 면을 사전에 70% 알코올로 소독하고 건조해 준비하 였다. 화상병균을 접종할 위치는 가로 1 cm×세로 1 cm 크기로 3번 반복하여 매직펜으로 표시하여 준비하였 다. 표면 오염을 위해서는 농도별로 희석한 세균액 50 μl 를 마이크로파이펫으로 각각 접종하여 방치한 후 액 체가 건조된 시점에서 ATP 발광검출기 분석을 수행 하였다. 세균액의 농도는 50 μl 당 2.15 × 102 부터 2.15 × 1010 cells까지 저농도부터 고농도 까지 범위에 서 접종하였다. 음성대조군으로서는 PBS buffer 를 접 종 하였다. 양성대조군으로서는 접종에 사용한 각 농 도 별 세균액을 직접 사용하였다. ATP 검출기기가 2 종인바 2세트로 모든 표면오염을 준비하여 사용하였다.

    2.3 ATP 발광검출 분석

    ATP 발광검출기의 범용성을 고려하여 2개 회사의 제품을 사용하여 조사하였다. 하나는 표면 위생을 모 니터하는 휴대용 Lumitester Smart ATP 형광검출기 (Kikkoman A3, Kikkoman Biochemifa Company, Tokyo, Japan)로서 회사 자체에서 공급하는 LuciPac A3 Surface 반응시약을 사용하였다. 이 제품은 AOAC Research Institute Performance Tested MethodsSM Program으 로부터 스탠레스강 표면의 위생검사를 위해 검증받 은 제품이다(Tanaka et al., 2020). 반응 시약은 ATP+ ADP+AMP를 감지하여 표면 청결도를 확인할 수 있 는 용도로 제조된 것이다(Sakurai and Nishimoto, 2019). 다른 하나는 3MTM Clean-TraceTM Luminometer ATP 형광검출기(LM1, St. Paul, MN, USA) 이다. 반응 시약으로서 3MTM Clean-TraceTM ATP Test (ATP kiot) 과 함께 사용하여 ATP를 감지하여 미생물 오염을 확 인한다. 이 기기 또한 AOAC로부터 인증을 받은 제품 이다.

    표면 오염 검출은 각 검출기기의 제조사에서 제공 하는 검출 요령에 따라 수행하였다. 제공된 측정용 시 약봉으로 가로 1 cm×세로 1 cm 크기에 농도별로 접 종된 세균을 충분히 좌우 위아래로 swab 하여 균체를 모두 채취 후 제공된 시약과 반응 후 검출기에 삽입 하여 측정된 ATP 의 RLU 값을 얻었다. 측정을 마친 후 세균 접종 표면은 모두 70% 알코올과 2% 락스로 멸 균하였다. 동시에 세균 검출실험에 사용한 모든 재료 는 생물안전실험실에서 고압멸균기로 살균하여 안전 관리를 수행하였다.

    2.4 통계 분석

    측정된 각 표면별, 화상병균 농도별 ATP 측정값(RLU) 의 평균과 표준오차를 구하였다. 표면별로 각 세균농 도에 반응하는 RLU 값의 상관을 구하였다. 통계 분석 은 엑셀 프로그램의 최소자승법을 이용하여 결정계 수 R2를 구하였다.

    3. 결과 및 고찰

    미생물을 다루는 생물안전작업대는 생물학적 재료 의 오염 및 작업자의 안전을 도모하기 위하여 사용되 는 장비이다(Meechan and Wilson, 2006). 화상병균의 분자적 진단 및 유전연구에서도 기본적으로 가장 사 용 빈도가 높은 장비이다. 생물안전작업대의 작업 공 간 바닥은 스텐인리스강으로 되어 있어 이곳에서 화 상병균의 오염도를 세균 수별로 측정한 결과는 Table 1과 같다. Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 세균수 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값 은 16.7에서 26.7로서 수치의 커다란 증가는 보이지 않 았다. 세균 수 2.15 × 107에서부터는 RLU 값이 42.4으 로서 조금 구별되는 양상을 보였으며 2.15 × 108 이상 부터는 확실하게 구별되었다. RLU 값에 의한 화상병 균의 생물안전작업대 오염도 인지는 세균수가 많아 질수록 더욱 확실하였다. 3M 사의 ATP 측정기의 경 우도 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값은 13.0에서 14.7로서 수치의 커다란 증가는 보 이지 않았다. 또한 세균 수 2.15 × 107에서부터는 RLU 값이 25.0으로서 조금 구별되는 양상을 보였으며 2.15 × 108 이상부터는 290 이상으로서 확실하게 구별 되었다. 그러나 세균수 2.15 × 109 이상에서는 3M사의 검출기 값이 Kikkoman사 검출기 값보다 훨씬 높게 나 타나는 차이가 있었다.

    생물안전작업대 스테인리스강 표면의 세균 수 증 가에 따른 ATP 측정값인 RLU와의 상관관계를 본 결 과 Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 결정계수 R2 값이 0.9995이었고 3M 사의 ATP 측정기의 경우는 0.9999이 었다(Fig. 1). 이는 스테인리스강 표면의 세균 수와 세 균의 ATP 측정값이 상당히 상관이 높다는 것을 나타 낸다.

    생물안전실험실의 실험 대부분을 수행하는 과학실 험대는 일반적으로 물리, 화학, 생물 등의 실험을 하 기 위한 테이블로서, 그 상판은 각종 화학약품 등과 접촉되기도 하고, 물리적 또는 기계적 충격을 받기도 한다. 따라서 실험대 상판은 내약품성과 내화학성이 뛰어나면서도 내충격성 및 내마모성이 뛰어난 소재 로 제작한다. 또한, 실험대에서 실험 도중, 가열이 필 요한 실험의 경우 예기치 않게 발화가 일어날 수도 있 는바 실험대 상판은 내화성이 요구된다. 이러한 특성 을 가지는 과학실험대 표면에 화상병균의 오염도를 세균 수별로 측정한 결과는 Table 2과 같다. Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 세균수 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값은 생물안전작업대 스텐인리스강의 같은 세균 수에 비하여서는 RLU 값 이 상향되었으나 실험대에서는 수치의 증가가 거의 보이지 않았다. 세균 수 2.15 × 107에서도 RLU 값이 274 로서 구별되지 않았다. 세균 수 2.15 × 108부터 RLU 값 은 증가가 구분 가능하였다. 3M 사의 ATP 측정기의 경우도 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값은 55.3에서 63.3로서 수치가 눈에 띄게 증가는 보이지 않았다. 그러나 2.15 × 107부터는 Kikkoman사 ATP 측정기와 달리 3M 사의 ATP 측정기의 경우 119.3 로서 RLU 증가가 구분 가능하여 오염 여부를 판가름 할 수 있었다. 세균 수 2.15 × 108부터 RLU는 더욱더 증 가가 뚜렷하여 오염여부가 확실히 구분이 가능하였다.

    과학실험대 표면의 세균 수 증가에 따른 ATP 측정 값인 RLU와의 상관관계를 본 결과 Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 결정계수 R2 값이 0.995이었고 3M 사 의 ATP 측정기의 경우는 0.997이었다(Fig. 3). 이는 과 학실험대 표면의 세균 수와 세균의 ATP 측정값의 상 관이 매우 높음을 나타낸다.

    생물안전실험실 바닥 표면은 누수를 방지하기 위 해서 테라조 지지대 위에 한번 더 PVC코팅된 데코타 일을 깔아서 충격을 방지하고 있다. 이러한 바닥 표 면에 화상병균의 오염도를 세균 수별로 측정한 결과 는 Table 3과 같다. Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 세 균수 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값은 수치의 증가가 거의 보이지 않았다. 세균 수 2.15 × 107에서도 RLU 값이 79.7로서 값의 차이가 구별 되지 않았다. 세균 수 2.15 × 108부터 RLU는 409.7로서 증가가 구분 가능하였다. 3M 사의 ATP 측정기의 경 우도 2.15 × 102에서부터 2.15 × 107 범위에서 측정된 RLU 값은 15.7에서 40.0으로서 수치가 눈에 띄게 하는 증가는 보이지 않았다. 그러나 2.15 × 108부터는 Kikkoman사 ATP 측정기와 달리 3M 사의 ATP 측정기의 경 우 417.3으로서 RLU 증가가 구분 가능하여 오염 여부 를 판가름할 수 있었다. 세균 수 2.15 × 109부터는 RLU 는 더욱더 증가가 뚜렷하여 오염여부가 확실히 구분 이 가능하였다. 세균수가 낮은 범위에서 두드러진 특 성은 생물안전작업대나 과학실험대에 비하여 100 RLU 이내에서 RLU 수치의 변동이 심하였다. 표면에 굴곡 이 있거나 표면 장력이 강하면 표면에 세균이 부착되 어 swab 시 닦여 나오는 효율이 저하될 수 있기 때문 에 이러한 RLU 값의 변동차이는 아마도 바닥면의 표 면이 다른 2가지 재료의 표면보다 거칠거나 빈번한 사용으로 인하여 마모되었거나 PVC 코팅 면의 특성 에 의거하여 화상병균을 swab을 하는데 있어서 차이 가 생겨나서 나온 결과로 추정된다.

    실험실 바닥 표면의 세균 수 증가에 따른 ATP 측정 값인 RLU와의 상관관계를 본 결과 Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 결정계수 R2 값이 0.9827이었고 3M 사 의 ATP 측정기의 경우는 0.987이었다(Fig. 3). 이는 과 학실험대 표면의 세균 수와 세균의 ATP 측정값의 상 관이 매우 높음을 나타낸다. 그러나 생물안전작업대 표면이나 과학실험대 표면의 결정계수 R2 값과 비교 하면 다소 수치가 낮아진 것을 알 수 있다. 이는 생물 안전작업대 표면이나 과학실험대 표면에 비하여 실 험실 바닥 표면에서의 균체 모니터링에 다소 편차가 생길 수 있음을 암시한다.

    공기 중으로 미생물을 부유시키는 에어로졸 발생 실험에는 챔버가 활용되고 있다(ISO, 2019). 챔버에서 는 공기 중에 부유된 미생물이 자연적으로 낙하하여 침강하면서 바닥에 앉거나 벽면에 부착되게 된다. 본 연구에서 아크릴로된 챔버의 바닥 표면에서 화상병 균의 오염도를 세균 수별로 측정한 결과는 Table 4와 같다. Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 세균수 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값은 2.3 에서 4.7사이로 수치의 증가가 거의 보이지 않았다. 세 균 수 2.15 × 107에서 RLU 값이 24로서 값의 차이가 다 소 구별되었다. 세균 수 2.15 × 108부터 RLU 값은 193 이상으로서 증가가 구분 가능하였다. 3M 사의 ATP 측 정기의 경우도 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값은 5에서 8.7사이로서 수치의 증가는 보이지 않았다. 그러나 2.15 × 107부터는 122로서 Kikkoman사 ATP 측정기 처럼 값의 차이가 다소 구별 되었다. 세균 수 2.15 × 108부터 RLU는 1,454.3 이상으 로서 오염여부가 확실히 구분 가능하였다. 세균수가 낮은 범위에서 두드러진 특성은 생물안전작업대, 과 학실험대, 실험실 바닥에 비하여 RLU 값이 10 이하로 서 매우 낮은 특성을 보였다. 그러나 공통되게 세균 수가 증가하여도 RLU 값 증가가 두드러지게 변하지 않았다. 이러한 결과는 또다시 실험실 내 표면 특성 에 따라 오염 세균에 대한 ATP 측정값이 달리 나올 수 있음을 보여준다.

    실험실 아크릴챔버 바닥 표면의 세균 수 증가에 따 른 ATP 측정값인 RLU와의 상관관계를 본 결과 Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 결정계수 R2 값이 0.9849이었고 3M 사의 ATP 측정기의 경우는 0.996이 었다(Fig. 3). 이 또한 아크릴챔버 바닥 표면의 세균 수 와 세균의 ATP 측정값의 상관이 매우 높음을 나타낸다.

    표면에 세균을 오염시킨 후 ATP 측정을 통해 오염 도를 살펴본 Table 1부터 Table 4 까지의 결과를 살펴 보면 세균수 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106까지는 세균 수가 증가하여도 RLU 값이 변동하는 폭이 크지 않아 표면의 특성 이외에 세균 자체의 반응을 생균을 대상 으로 조사하였다. Kikkoman사 ATP 측정기의 경우 세 균수 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값은 7.7에서 13.3 사이로 수치의 증가가 다시금 거의 보이지 않았다. 세균 수 2.15 × 107에서 조차도 RLU 값이 11.7 로서 값의 차이가 2.15 × 107 이하 세균 수와 구별되지 않았다. 세균 수 2.15 × 108부터 RLU는 26.7 로서 근소하게 증가하여 구분 가능하였다. 세균 수 2.15 × 109 이상에서 좀 더 뚜렷하게 오염을 판정할 정 도인 RLU 값 122 이상을 나타내었다. 3M 사의 ATP 측 정기의 경우도 2.15 × 102에서부터 2.15 × 106 범위에서 측정된 RLU 값은 17.3에서 25.3 처럼 값의 차이가 크 지 않게 구별되었다. 세균 수 2.15 × 107에서도 매우 근 소하게 RLU 값은 30을 나타내었다. 세균 수 2.15 × 108 부터 RLU 값은 320.3 이상으로서 오염 여부가 확실히 구분 가능하였다. 이 결과는 표면의 세균 오염도 측 정과 유사하게 생균에서도 균수의 증가에 따른 ATP 측정값인 RLU 값의 증가가 세균수 2.15 × 107 이하까 지는 변화가 있지만 급격하게 변화를 보이지 않음을 보여준다. 이는 화상병균인 E. amylovora의 고유한 특 성에서 나오는 것으로 사료된다.

    검출 민감도와 관련하여 두 개 ATP 측정 기기의 측 정치를 비교하여 보았다. 대체적으로 RLU 값의 변화 폭을 나타낸 세균수가 2.15 × 106와 2.15 × 107 인바 이 들 세균수를 대상으로 Table 1 부터 Table 5까지 나타 난 측정값을 살펴보았다. 이들 두개 세균 수에서 생 물안전작업대, 과학실험대, 실험실 바닥에 표면 swab 후 조사된 RLU 값은 모두 3M사의 제품이 Kikkoman 사 제품보다 낮았다. 그러나 아크릴챔버 바닥 표면과 생균 수 측정에 있어서는 모두 3M사의 제품이 Kikkoman사 제품보다 높았다. 세균 수가 아주 높은 범 위인 2.15 × 107에서 2.15 × 1010까지 모두 3M사의 제품 이 Kikkoman사 제품 보다 높았다. 본 연구에서 화상 병균 오염 검출을 위한 두 회사 제품 간에 ATP 측정 값은 세균 수가 가지는 범위에 따라 차이가 있음을 볼 수 있었다.

    화상병 생균의 세균 수 증가에 따른 ATP 측정값인 RLU와의 상관관계를 본 결과 Kikkoman사 ATP 측정 기의 경우 결정계수 R2 값이 0.9999이었고 3M 사의 ATP 측정기의 경우는 0.9992이었다(Fig. 3). 이는 생균 의 세균 수와 세균의 ATP 측정값의 상관이 매우 높음 을 나타낸다.

    4. 결 론

    이상의 실험실의 표면 오염 가능성을 두고 ATP 측 정기를 이용한 화상병균의 검출 가능성을 조사한 결 과는 세균 수에 따라 검출 정도가 달라질 수 있음을 보여주었다. 표면 1 cm2 면적에서 세균수 2.15 × 106 범 위까지는 RLU 값에 기반하여 오염도가 높게 측정되 지 않음을 볼 수 있었다. 세균수 2.15 × 107 이상에서는 100 RLU 이상으로 충분히 오염도를 인식할 수 있었 다. ATP 형광발광 분석은 환경의 미생물 오염 평가에 서 배양 방법을 아직까지 대체할 수 없는 것은 사실 이다. 그러나 실행이 쉽고 결과가 즉각적이기 때문에 표면을 더 자주 그리고 더 많이 모니터링할 수 있다. 병원 등 보건분야에서는 소독 세척 절차의 효능을 선 별하는 신속한 도구로도 사용할 수 있다(Amodio and Dino, 2014). 고위험 식물병원체 연구실에서 실험실과 온실 등 연구 활동 범위가 넓은 경우는 오염이 매우 심한 곳을 즉각적으로 찾아내는 방편으로서 ATP 측 정기의 활용을 검토해 볼 수 있을 것으로 사료된다. 그 러나 아직 획득한 ATP 결과를 해석하기 위해서는 다 양한 연구실 현장과 여러 가지 측정기기의 검출 정도, 세균의 생리적 상태 변화에 따른 측정값 변화, 조사 환경 유형에 따른 측정값 표준화, 연구 환경의 위험 수준, 공간적 및 시간적으로 샘플링 정도 등 다각적 으로 수집된 데이터 분석을 기반으로 오염 판단을 위 한 기준값을 설정하는 자료가 더 도출되어야 할 것으 로 사료된다. 더불어 오염판단 기준값에 대한 편차 범 위에 대한 연구도 함께 진행되어야 할 것이다. 본 연 구결과는 화상병균에 대한 기초 조사로서 향후 이러 한 자료 도출을 위해 유용한 기반 정보로 활용이 기 대된다.

    감사의 글

    This work was carried out with the support of "Cooperative Research Program for Agriculture Science & Technology Development (Project No. PJ014219)", RDA, Republic of Korea. The Department of Microbiology was supported through the Research Focused Department Promotion Project as a part of the University Innovation Support Program for Dankook University in 2022.

    Figure

    JOIE-21-4-324_F1.gif

    Correlation between the relative light unit (RLU) values measured by two different ATP bioluminometers (upper: Kikkoman, lower: 3M) and E. amylovora cells (CFU/cm2) contaminated on the disinfected bench floor of a biosafety cabinet (Class 2 Type A1) in a biosafety laboratory (BSL 2 class) .

    JOIE-21-4-324_F2.gif

    Correlation between the relative light unit (RLU) values measured by two different ATP bioluminometers (upper: Kikkoman, lower: 3M) and E. amylovora cell concentration (CFU/cm2) contaminated on a part of disinfected surface of a lab bench in a biosafety laboratory (BSL 2 class).

    JOIE-21-4-324_F3.gif

    Correlation between the relative light unit (RLU) values measured by two different ATP bioluminometers (upper: Kikkoman, lower: 3M) and E. amylovora cell concentration (CFU/cm2) contaminated on a part of the disinfected floor in a biosafety laboratory (BSL 2 class).

    JOIE-21-4-324_F4.gif

    Correlation between the relative light unit (RLU) values measured by two different ATP bioluminometers (upper: Kikkoman, lower: 3M) and E. amylovora cell concentration (CFU/cm2) contaminated on a part of disinfected floor of an acryl chamber in a biosafety laboratory (BSL 2 class).

    JOIE-21-4-324_F5.gif

    Correlation between the relative light unit (RLU) values measured by two different ATP bioluminometers (upper: Kikkoman, lower: 3M) and E. amylovora cell concentration (CFU/mL).

    Table

    Luminescence measurements (RLU) of E. amylovora cells (CFU/cm2) contaminated on the disinfected bench floor of a biosafety cabinet (Class 2 Type A1) in a biosafety laboratory (BSL 2 class) using two different ATP bioluminometers

    Luminescence measurements (RLU) of E. amylovora cells (CFU/cm2) contaminated on a part of disinfected surface of a lab bench in a biosafety laboratory (BSL 2 class) using two different ATP bioluminometers

    Luminescence measurements (RLU) of E. amylovora cells (CFU/cm2) contaminated on a part of the disinfected floor in a biosafety laboratory (BSL 2 class) using two different ATP bioluminometers

    Luminescence measurements (RLU) of E. amylovora cells (CFU/cm2) contaminated on a part of disinfected floor of an acryl chamber in a biosafety laboratory (BSL 2 class) using two different ATP bioluminometers

    Luminescence measurements (RLU) of E. amylovora cells (CFU/mL) using two different ATP bioluminometers

    Reference

    1. Amodio, E. , Dino, C. ,2014. Use of ATP-bioluminescence for assessing the cleanliness of hospital surfaces: a review of the published literature (1990-2012). Journal of Infection and Public Health 7(2), 92-98.
    2. Aycicek, H. , Oguz, U. , Karci, K. ,2006. Comparison of results of ATP bioluminescence and traditional hygiene swabbing methods for the determination of surface cleanliness at a hospital kitchen. International Journal of Hygiene and Environmental Health 209(2), 203-206.
    3. Chen, F. C. , Godwin, S. L. ,2006. Comparison of a rapid ATP bioluminescence assay and standard plate count methods for assessing microbial contamination of consumers’ refrigerators. Journal of Food Protection 69(10), 2534-2538.
    4. Doolotkeldieva, T. , Bobusheva, S. ,2016. Fire blight disease caused by Erwinia amylovora on Rosaceae plants in Kyrgyzstan and biological agents to control this disease. Advances in Microbiology 6(11), 831.
    5. Drenova, N. V. , Isin, M. M. , Dzhaimurzina, A. A. , Zharmukhamedova, G. A. , Aitkulov, A. K. ,2013. Bacterial fire blight in the Republic of Kazakhstan. Plant Health Research and Practice 1, 44-48.
    6. Duffy, B. , Schärer, H. J. , Bünter, M. , Klay, A. , Holliger, E. ,2005. Regulatory measures against Erwinia amylovora in Switzerland. EPPO Bulletin 35(2), 239-244.
    7. El-Helaly, A. F. , Abo El-Dahab, M. K. , ElGoorani, M. A. ,1964. The occurrence of the fire blight disease of pear in Egypt. Phytopathologia Mediterranea 3(3), 156-163.
    8. Fatmi, M. , Bougsiba, M. , Saoud, H. ,2008. First report of fire blight caused by Erwinia amylovora on pear, apple, and quince in Morocco. Plant Disease 92(2), 314-314.
    9. International Organization for Standardization (ISO),2019. Indoor air - Part 36: Standard method for assessing the reduction rate of culturable airborne bacteria by air purifiers using a test chamber. ISO 16000-36, 2018.
    10. Khan, M. A. , Zhao, Y. F. , Korban, S. S. ,2012 Molecular mechanisms of pathogenesis and resistance to the bacterial pathogen Erwinia amylovora, causal agent of fire blight disease in Rosaceae. Plant Molecular Biology Reporter 30, 247-260.
    11. Kim, Y. S. , Moon, H. K. , Kang, S. I. , Nam, E. J. ,2010. Verification of the suitability of the ATP luminometer as the monitoring tool for surface hygiene in foodservices. Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition 39(11), 1719-1723.
    12. Lagonenko, A. L. , Komardina, V. S. , Nikolaichik, Y. A. , Evtushenkov, A. N. ,2008. First report of Erwinia amylovora fire blight in Belarus. Journal of Phytopathology 156(10), 638-640.
    13. Lee, H. J. , Lee, S. W. , Suh, S. J. , Hyun, I. H. 2022. Recent spread and potential pathways for fire Lblight in South Korea. EPPO Bulletin 52(1), 135-140.
    14. Mansfield, J. , Genin, S. , Magori, S. , Citovsky, V. , Sriariyanum, M. , Ronald, P. , Dow, M. , Verdier, V. , Beer, S. V. , Machado, M. , Toth, I. , Salmond, G. , Foste, G. D. ,2012. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology 13(6), 614-629.
    15. Meechan, P. J. , Wilson, C. ,2006. Use of ultraviolet lights in biological safety cabinets: a contrarian view. Applied Biosafety 11(4), 222–227.
    16. Park, D. H. , Yu, J. G. , Oh, E. J. , Han, K. S. , Yea, M. C. , Lee, S. J. , Myung, I. S. , Shim, H. S. , Oh, C. S. ,2016. First report of fire blight disease on Asian pear caused by Erwinia amylovora in Korea. Plant Disease 100(9), 1946-1946.
    17. Sakurai, K. , Nishimoto, K. ,2019. Evaluation of additional validation study of new luminometer for LuciPakTM A3 Surface for hygiene monitoring through detection of ATP, ADP, and AMP. AOAC Performance Tested MethodsSM certification number 051901.
    18. Shtienberg, D. , Manulis-Sasson, S. , Zilberstaine, M. , Oppenheim, D. , Shwartz, H. ,2015. The incessant battle against fire blight in pears: 30 years of challenges and successes in managing the disease in Israel. Plant Disease 99(8), 1048- 1058.
    19. Sletten, A. , Talgø, V. , Rafoss, T. , Melbøe, N. S. 2017. Fire blight in Norway: a review of strategies and control measures from 1986 to 2016. Journal of Plant Pathology 99, 137-139.
    20. Smits, T. H. M. , Guerrero-Prieto, V. M. , Hernández- Escarcega, G. , Blom, J. , Goesmann, A. , Rezzonico, F. Duffy, B. , Stockwell, V. O. ,2014. Whole-genome sequencing of Erwinia amylovora strains from Mexico detects single nucleotide polymorphisms in rpsL conferring streptomycin resistance and in the avrRpt2 effector altering host interactions. Genome Announcement 2: e01229-01213.
    21. Tanaka, N. , Saito, W. , Bakke, M. , Sakurai, K. , Nishimoto, K. ,2020. Validation study of LuciPacTM A3 Surface for hygiene monitoring through detection of ATP, ADP, and AMP from stainless steel surfaces. AOAC Performance Tested MethodsSM certification number 051901. Journal of AOAC International 103(4), 1090-1104.
    22. Vanneste, J. L. ,2000. Fire blight; the disease and it causative agent, Erwinia amylovora. Cabi Publishing, Wallingford, UK.
    23. Wang, J. , Gao, J. C. , Bayinkexike, Muyassar, M. , Zhang, J. H. , Tian, Y. L. , Hu, B. S. ,2021. Block the field spread of fire blight by electric heating automatic disinfection pruning. Plant Quarantine 36(2), 25-28