1. 서 론
Adenosine triphosphate (ATP)는 포도당의 분해 과정 에서 생산되는 에너지 운반 물질로서 살아 있는 생물 체의 활성을 나타내는 중요한 대사 물질이다. 이 물 질은 반응액에 들어 있는 Luciferin 및 Luciferase와 반 응하면 발광하게 되는데 이 발광되는 정도를 ATP Luminometer를 이용하여 상대적 광 단위(Relative Light Unit, RLU)를 측정함으로써 ATP 양을 알 수 있다(Chen and Godwin, 2006). 이렇게 ATP를 측정하는 방법은 ATP bioluminescence법으로 불리는데 간단히 ATP 측 정법이라고도 한다. 이 측정방법은 일반적으로 식품 위생 분야에서 세균 오염 정도를 측정하기 위해 주로 사용되고 있다(Griffiths, 1993;Stanley et al., 1989;Stannard and Wood, 1983). 사실 이 방법은 다양한 시 료에 존재하는 세균 오염을 검출해내기 위한 측정법 으로서 고감도이며 ATP와 같이 미생물의 생존에 필 수적인 물질의 존재 유무를 신속하게 검출함으로써 신속한 오염평가가 가능하다. 이에 따라 측정 또는 검 출하고자 하는 시료에서 직접 세균을 분리 배양하여 오염을 확인하는 방법보다 소요 시간이 크게 단축된다.
국내에서는 이러한 ATP 측정법의 장점을 활용하여 ATP Luminometer를 다양한 식품 생산 현장 및 관련 분야에서 실시간 모니터링 도구로 활용하고 있다(Kim et al., 2010). 또한 근래에는 ATP 측정방법의 실제 사 례연구법이 다양하게 존재하여 더욱 많은 분야에서 구체적인 활용방안이 제시되고 있다.
더욱이 ATP Luminometer를 이용하면 실시간 미생 물 또는 시간이 경과함에 따른 잔존 세균의 여부뿐만 아니라 소독제 활성에 영향을 줄 수 있는 유기물의 잔 류 여부까지 확인하며 위생 모니터링을 진행할 수 있 다(Hawronskyi and Holah, 1997;Kim and Kim, 2010). ATP Bioluminescence 결과값과 표준평판 균수를 측정 비교한 결과, 측정값은 84.7%의 일치도를 보여 미생 물 품질관리평가에 ATP Bioluminescence의 이용 가능 성이 높은 것으로 파악되고 있다(Park, 2000). 그 결과 과거엔 주로 식품 분야에서 주로 사용되었지만 지금 은 실내 주거환경의 오염도 분석, 공공시설의 오염도 분석 등으로 사용 분야가 확대되고 있다. 특히, 최근 문화재 보존분야에서는 석조문화재의 생물막(biofilm) 을 제거하기 위해 사용된 천연살생물질의 효과를 판 정하기 위하여 ATP Bioluminescence 측정법을 사용하 고 그 적용 가능성이 보고된 바 있다(Jeong et al., 2018).
그러나 실내의 서고나 자료실 같은 곳에 존재하는 종이 기록물의 오염 상태를 판가름하는데 적용한 사 례는 거의 없는 실정이다. 이 같은 종이 기록물의 표 면에 존재하는 세균의 오염도 평가하기 위해서는 종 이 표면에서 세균을 측정하는 것이 실현 가능한 것인 지에 대한 자료가 우선 요구된다. 이에 따라 본 연구 는 종이에서의 세균 오염 정도 평가에 ATP Luminometer를 이용할 수 있을지 알아보고자 수행되었다.
2. 재료 및 방법
2.1 시험 세균 균주 및 균주 배양
본 연구를 위해서 사용한 세균 균주는 단국대학교 미생물학과 진균생명공학연구실에 보관중인 국내 실 내환경에서 분리하여 동정된 Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus 등의 세균을 사용하였다. 초저 온냉동고에 보관하던 세균을 Tryptic Soy Agar (TSA, BD Science)에 획선 접종하고 37°C에서 2일간 배양 후 활성화시킨 다음 시험에 사용하였다. 고체배지 배양 은 TSA를 사용하였고 멸균수 1 L에 TSA 배지 파우더 40 g과 agar 15 g를 첨가하여 섞어준 후 121°C, 1.5 ~ 2.0 기압에서 20분간 고압살균기로 멸균한 뒤 45°C로 식 힌 다음 90 mm Petri dish에 20 ml 씩 분주하여 제작하 였다. 액체배지에서의 세균 배양은 고체배지에 자란 세균 콜로니 한 개를 50 mL 멸균 plastic tube (NaviMRO Co., Seoul, Korea)에 담긴 20 mL Tryptic Soy Broth 에 접종한 후 회전배양기를 이용하여 200 rpm으로 37°C 에서 18시간 배양하여 사용하였다. 세균수는 Marienfeld SuperiorTM Counting Chamber with Bright Line Double Net Ruling (Fisher Scientific, Oslo, Norway)로 계수하 고 멸균수로 희석하여 100~ 108 cells/50 μl 범위로 농도 를 조절하였다.
2.2 세균 오염 종이 시료 제조
종이는 A4 인쇄용지(Double A)를 비롯하여 백상지 (fine print paper), 중질지(medium print paper), 갱지 (ground paper), 신문지(newsprint paper), 습자지 (practice paper), 트레싱지(tracing paper)를 구입하여 사용하였다. 종이를 2 × 2 cm2로 잘라서 생물안전작업 대에서 설치된 자외선으로 앞면 뒷면 각각 10분씩 조 사하여 표면 살균을 수행하여 무균 종이시료를 준비 하였다. 준비된 종이 표면에 세균 오염은 농도별로 제 조된 세균 현탁액을 마이크로파이펫으로 50 μl 씩 각 각 3반복으로 점적하여 접종하고 생물안전작업대(BL2 급)에서 30분간 방치하여 물기를 건조시켜 세균 오염 종이시료를 제작하였다.
2.3 ATP 측정
ATP luminometer는 국내에서 널리 판매된 Teltron 사(Daejeon, Korea)에서 제공하는 Clean-Q, Kikkoman Biochemifa 사(Tokyo, Japan)에서 제공하는 Lumitester smart PD-30, 3M 사(St. Paul, MN, USA)에서 제공하 는 3MTM Clean-TraceTM LM1 ATP System 등 3개 회 사 제품을 이용하였다. ATP luminometer를 이용한 ATP 측정은 각 회사에서 제공하는 사용방법에 따라 수행하였다. 종이 표면에서의 ATP 측정은 각 회사의 측정킷에서 제공하는 면봉을 각각 사용하였다. 시료 채취 면봉 표면 특성 조사는 육안과 Olympus SZX7 실 체현미경(Olympus Life Science Com., Tokyo, Japan) 으로 조사하였다. 종이 표면에 접종된 세균을 면봉으 로 여러 차례 문질러 닦아낸 후 제공된 반응시약에 담 가 여러 차례 흔들어 반응시킨 다음 luminometer에 넣 어서 측정값(RLU)을 확인하였다. 측정 결과는 엑셀 과 SPSS 통계프로그램을 이용하여 세균 CFU와 RLU 값과의 상관관계를 분석하였다. 모든 측정 작업은 생 물안전작업대(BL2 급)에서 수행하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 ATP luminometer 의 일반적인 검출 정도 조사
종이에서의 오염도 측정 시험전에 사용하는 3개 회 사의 ATP luminometer 기기 간에 검출 차이가 있는지 알아보고자 우선 일상생활에서 세균이 있을 만한 곳 을 대상으로 측정을 시도하였다. 측정은 20대 남녀를 대상으로 교육을 실시한 뒤 무작위로 진행하였다. 서 로 다른 사람이 가지고 있는 손, 펜, 필통, 노트, 안경, 컵 손잡이, 플라스틱 카드(신용카드, 교통 카드 등), 지 갑, 테이블, 실험복, 핸드폰 등을 대상으로 표면을 면 봉으로 문질러 ATP를 측정하였다(Table 1). Smart PD- 30로 경우 RLU 수치는 최소 32에서 최대 11,472로 분 포하였다. Clean-Q의 경우는 최소 7에서 최대 1,271의 분포를 보였다. LM1의 경우는 최소 29에서 최대 36,615 의 분포를 보였다. 3가지 기기로 측정을 진행한 결과, 여러 재질에서 다양한 범위에서 RLU 값이 측정되는 것으로 나타났다. 이것으로 보아 측정 대상에 무관하 게 기기 작동에는 문제가 없는 것으로 사료되어 이들 기기를 사용하여 시험을 계속 진행하였다.
3.2 세균 농도에 따른 ATP 측정 값 비교
실내에서 가장 빈도 높게 나타나는 세균인 Micrococcus luteus를 대상으로 세균 농도에 따른 3개 ATP luminometers 의 측정값은 Table 2와 같다. RLU 최대 측정 수치가 가장 높은 것은 smart PD-30로 나타났고, 다음으로 LM1이 높게 나타났다. 측정 결과, 108 CFU/ 50 μl에서 가장 높은 RLU 값을 보여주었고 농도가 감 소함에 따라 RLU 값도 감소하는 성향을 보여주었다. 가장 높은 측정 감도를 보여준 기기는 smart PD-30였 으며, Clean-Q의 경우 최대 측정가능 수치가 9,999 RLU 인 것으로 나타났다. 낮은 농도에서는 차이가 크지 않 았으나 세균은 104 CFU/50 μl 농도 수준에서부터 측정 장비에 따라 RLU 값의 차이가 있었다. 107 ~ 108 CFU/ 50 μl 수준에서 각각의 제조사의 제품 모두 유의미한 RLU 값 측정이 어려운 것으로 보여지고, 103~ 106 CFU/ 50 μl 범위에서 유의미한 측정값을 갖는 것을 보여준 다. 동일한 양의 M. luteus CFU/50 μl를 접종하였을 때 가장 높은 측정값을 보여준 smart PD-30 기기를 기준 으로 LM1(3M)을 106 부터 103 농도까지 RLU 값을 비 교하였을 때, 각각 347.2%, 375. 8%, 227. 8%, 133.34% 으로 최대측정수치는 낮지만 smart PD-30 기기보다 높은 RLU 측정값이 나왔다. 동일한 방법으로 Clean- Q는 M. luteus CFU/50 μl의 106 부터 103 까지 RLU 값 을 비교하였을 때, 각각 77.42%, 62.75%, 45.03% 으로 smart PD-30보다 낮은 RLU 측정값이 나왔다. 103 ~ 106 CFU/50 μl 범위 Duncan 다중비교 결과 유의수준 0.05 에서 3개 ATP luminometers 간에 측정값 차이가 존재 하였다.
3.3 종이에서 세균 종과 농도에 따른 ATP 측정 값 비교
Table 2의 결과를 바탕으로 종이에서 세균 오염 측 정을 시도하였다. A4 인쇄용지에 Bacillus subtilis, Escherichia coli, Micrococcus luteus을 농도별로 접종하 고 조사한 결과는 Table 3과 같다. 10의 배수로 세균 농 도를 높여가며 실험을 진행한 결과 최소 1 × 106 cells/ 100 cm2의 세균이 존재해야 하는 것으로 나타났다. Clean-Q 경우 106~ 107 cells 수준에서 1,000 RLU 값을 넘지 못하였으나 LM1과 smart PD-30 는 3개 세균 모 두 넘었다. 106~ 107 cells 수준에서의 측정값은 smart PD-30 > LM1> Clean-Q 순이었다. 이는 3개 기기 간 차 이가 존재함을 보여준다. 흥미롭게도 미생물 종류에 따라 RLU 값에 차이도 존재하였다. 106~ 107 cells 세 균 농도에서 검출되는 정도에 있어서는 Bacillus subtilis > Micrococcus luteus > Escherichia coli 순이었다. 이는 어떠한 종의 세균이 종이 표면에 있느냐에 따라 ATP 측정 기기의 감도가 다를 수 있음을 시사한다.
한편 종이에서 3종 세균의 측정 민감도에 있어서 3 가지 ATP luminometer 기기 간 차이가 있음을 볼 수 있었는데 이러한 차이를 나타나게 하는 원인이 무엇 인지는 아직 확실하지 않다. 한가지 추정되는 원인 중 하나는 종이에 흡수되거나 부착된 미생물이 면봉으 로 문지르는 과정서 잘 닦여 나오지 않은 데서 발생 할 수 있을 것으로 추정된다. 이에 따라 면봉의 성상 을 조사하였다. Clean-Q 기기용 면봉은 smart PD-30 과 LM1 기기용 면봉과 달리 면봉이 살짝 젖어있었다 (Fig. 1). Smart PD-30 기기용 면봉의 표면 접촉 면적은 다른 2개 회사 제품 면봉보다 조금 더 넓었다. 이같이 좀 더 넓은 면적과 젖은 상태 등 면봉 표면의 물리적 성상 차이는 종이 표면을 문지르며 세균을 채취하는 데 영향을 주어서 ATP 측정기기 간에 측정값 차이가 나게 할 가능성 있다고 사료된다. 향 후 이에 대한 검 토가 필요하다.
3.4 종이 재질에 따른 오염 세균의 ATP 측정
종이는 사용 목적에 따라 제조되는 재료와 공정에 차이가 있어 종이 표면의 물리적 화학적 특성이 종이 종류마다 약간씩 다르다. 따라서 종이 표면에 세균이 오염되었을 경우 종이 표면에 부착되는 정도에 차이 가 있을 수 있다. 또한 표면 굴곡이 있으면 세균이 굴 곡진 곳에 존재할 수 있다. 세균이 종이 표면에 단단 히 부착하지 않거나 굴곡이 있는 곳에 존재한다면 ATP 기기 측정용 면봉으로 문질러도 쉽게 세균 시료가 채 취되지 않을 수 있다. 이 경우 세균의 오염 정도는 측 정하는데 검출에 영향을 줄 가능성이 있으므로 서로 다른 종이 재질에 같은 세균을 다양한 농도로 접종하 여 ATP luminometer로 검출되는 정도를 조사하였다. 이 실험을 위해서는 3종의 세균 중 실내환경에서 가장 빈도 있게 검출되는 Micrococcus luteus를 대표 오염 세 균으로 하여 수행하였다. 종이는 백상지, 갱지, 트레 싱지, 습자지, 중질지, 신문용지 등 6가지 다른 재질의 종이를 사용하였다. 백상지는 표백화학펄프 100%로 제조하고 도공처리 하지 않은 종이로서 각종 도서 및 간행물의 인쇄·출판 등에 사용되는 종이로서 표백화 학펄프 50% 이상 또는 이하로 기계펄프를 혼합하여 제조하고 도공처리 하지 않은 종이인 중질지와 다소 차이가 있다. 트레이싱지는 도면, 그림 따위를 투사하 는 데 쓰는 반투명의 얇은 종이로서 붓글씨 연습을 할 때 쓰는 반투명의 매우 얇은 종이인 습자지와 다소 차 이가 있다.
Smart PD-30 기기로 M. luteus 균이 접종된 6가지 종 이 표면으로부터 ATP 를 측정한 결과 RLU 값이 가장 큰 종이는 트레싱지였으며 그 다음으로는 백상지, 중 질지, 갱지, 신문지, 습자지 순이었다(Fig. 2). LM1 기 기로 측정하였을 때도 RLU 값을 가장 큰 RLU 값은 트 레싱지에서 나타났다(Fig. 3). 그 다음으로는 중질지, 갱지, 신문지, 습자지, 백상지 순이었다. 이러한 결과 는A4 인쇄용지를 사용한 Table 2 의 결과와 더불어 ATP luminometer 이용하여 종이 표면의 세균 오염도를 측 정할 경우 종이 재질에 따라 세균 검출 정도가 다를 수 있음을 보여준다.
한편 측정된 6가지 종이 재질별 세균 농도별 검출 에 대한 CFU 값과 ATP 측정의 RLU 값 간의 상관을 조 사한 결과는 Fig. 4와 5에 나타내었다. R2 값이 화학측 정에서 일반적으로 0.8 보다 큰 경우 유의미한데 본 측 정에서는 smart PD-30 기기로 측정한 경우 R2 값은 트 레이싱지가 0.995, 백상지가 0.9864, 중질지가 0.9459, 갱지가 0.9814를 나타내어 세균 오염도 측정에 유의 미한 종이 재질로 사료되었다. 신문지는 0.3622 습자 지는 그 이하로서 한계가 있었다. LM1 기기로 측정한 경우도 트레이싱지가 0.9993 중질지가 0.9711, 백상지 가 0.8574, 갱지가 0.8223 로서 유의미하게 나타났다. 신문지는 0.7583 습자지는 0.6822로써 화학측정에서 일반적으로 유의한 수치인 0.8 보다 작았다. 그렇지만 smart PD-30 기기로 측정한 경우의 R2 값 보다 다소 높 았고 0.8 값에 가까이 측정되는 특성을 보였다. 이는 기기에 따라서 혹은 종이의 종류에 따라서 통계적으 로 유의한 수준의 검출이 가능함을 보여준다.
이상의 결과를 종합해 보면 종이 재질별 2가지 ATP 측정 기기의 세균 검출 정도를 보았을 때 종이 표면 의 세균 오염을 측정한 경우 RLU 값이 1,000 수준이 면 105~ 106 CFU/4 cm2 정도의 매우 높은 세균 오염도 를 나타낸다고 볼 수 있다. 그러나 종이 표면에서의 세균 오염도는 대체적으로 Table 1에서 측정된 여러 가지 일상적인 물체의 표면보다 검출 민감도 낮음을 알 수 있다. 아직까지 국내외 적으로 종이 표면에서 세균 오염도를 ATP luminometer 로 측정한 연구 보고 가 매우 희귀한 바 본 연구는 종이에서의 세균 검출 에 대한 기초연구로서 선구적 자료를 제공한다.
종이로된 서적과 종이 지폐 등에서 세균 오염이 보 고되어왔다(Fisher and Rundels, 2023;Khalil et al., 2014). 특히 단백질 분해를 나타내는 세균 활동은 고 대의 양피지로 만든 문서와 책을 훼손하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Sterflinger and Pinar, 2013). 국내에서도 ATP 측정으로 기록물의 미생물 오 염정도를 조사한 바 있다(Kim et al., 2018). 앞으로 좀 더 다양한 종이 재료에 대해 세균 오염도를 ATP 측정 기로 조사한 자료가 모아지면 종이에서의 세균 오염 측정에 대한 과학적 이해를 돕고 ATP luminometer 의 활용 범위를 더 넓힐 수 있을 것으로 기대된다.
