1. 서 론
버섯재배에 사용되는 재배사는 주로 비닐하우스 재배 방식을 많이 사용하고 3중피복, 보온커튼, 차광막이 포함된 비닐하우스형태나 샌드위치패널의 하우스 형태를 사용한다(Ahn and Lee, 2016;Kwon et al., 2016). 버섯은 생육하는 동안 온도, 습도 등에 민감하기 때문에 재배사의 적절한 환경 조건 유지가 중요하다. 하지만 버섯 재배실의 실내 환경 조건은 실내 공 기 중 부유하는 세균의 생장에도 영향을 미칠 수 있다. 실내 공기의 부유세균은 중요한 실내 공기 오염 물질로 우리나라 환경부에서 다중이용시설의 유지기준으로 총부유세균을 800 CFU/m3 이하로 규정하고 있다(https://www.me.go.kr/home/web/main.do). 최근 느타리 재배실에서 실내 공기질을 조사했을 때 총부유 세균은 유지기준치를 초과했고 시기에 따라 부유세균의 종 변화가 다르게 나타났다(Jung et al., 2022). 또 한 부유세균 중에서는 인체 또는 식품 오염, 버섯 재배에 피해를 줄 수 있는 세균이 포함될 수 있다. 예를 들어 양송이 버섯 재배사에서 총부유세균을 검토했을 때, 인체 또는 식품에 영향을 미치는 세균이 동정 되었다(Kwon et al., 2015b). 또한 표고버섯 재배사의 실내공기질을 조사했을 때는 66.6%의 버섯 재배사가 기준치를 초과한 보고가 있기 때문에 버섯 재배사 실내에는 유해한 세균의 발생 가능성이 가변적으로 존재한다(Ahn et al., 2017).
기후온난화 영향으로 국내의 기후는 국립기상과학원의 보고에 의하면 최근 30년 동안 기온은 1900년대 초보다 1.4°C 정도 상승하였고 여름일수와 열대야 일 수가 증가하는 추세이다(NIMS, 2018). 이런 추세는 재배사 내의 온도 상승을 가져오는 바 기온에 민감한 버섯의 경우 재배 생산에 영향을 줄 수 있다. 이에 따라 최근 고온에서 재배가 가능한 버섯이나 품종을 이용하여 재배하려는 시도가 이루어지고 있다. 특히 여름철의 경우 외기의 기온이 매우 높기 때문에 재배사 내부의 온도도 이전 보다 높아지고 있는 실정이다. 버섯 재배환경은 일반적으로 습도가 높은데 재배사 내부 기온이 높아지면 세균의 번식이나 세균 종 다양성에 변화를 줄 가능성이 있다. 이러한 재배사내 세균의 번식과 변화는 버섯 생육에 영향을 미칠 수 있어서 재배관리는 물론 식품위생에도 영향을 줄 수 있어서 재배생산 과정에 있어서 위생관리가 필요하다. 그러나 실제 여름철 같이 기온이 높은 환경에서 고온성 버섯을 재배하는 버섯 재배사의 실내공기질 조사는 거의 이루어져 있지 않다.
본 연구는 고온성 버섯 재배사의 실내환경에서 부유세균에 대한 기초자료를 확보하기 위해 수행되었다. 이를 위해서 느타리 재배사, 밀키버섯과 신령버섯을 재배하는 재배사, 밀키버섯, 산느타리, 여름느타리를 동시 재배하는 재배사 등 총 3곳의 재배사를 대상으로 여름철 재배사의 실내 공기의 부유세균의 농도를 측정하고 어떤 종이 존재하는지 분리 및 동정을 수행하였다.
2. 재료 및 방법
2.1 버섯 재배사 온도, 습도 및 부유세균 측정
온도, 습도 및 부유세균 농도측정은 충청북도 충주시에 위치한 3중피복에 차광막과 관수 및 가습처리 시설이 포함된 비닐하우스로서 균상 재배가 이루어지는 재배사에서 수행하였다. 측정은 2022년도 4월과 5월에 느타리 재배실, 2023년도 7월과 8월에 밀키버 섯과 신령버섯 혼합재배실 그리고 밀키버섯, 산느타리, 여름느타리 혼합재배실 등에서 각각 수행하였다.
측정 빈도는 버섯 재배 시점에서 한달에 한번 진행하였다. 느타리는 재배사 주인의 개인상황에 따라 4월과 5월에 재배하였다. 농가의 온도와 습도는 Testo (Testo 625, Testo AG, Germany) 측정기를 사용하였다. 부유세균 측정은 환경부의 실내공기질 공정시험법에 따라 충돌법에 기반하여 Anderson sampler (Al-Doory, 1970)를 사용하여 재배사 내 중앙에서 삼각지지대에 고정시킨 후, 기기의 수평을 맞추어 수행하였다(Fig. 1). 부유세균 포집은 Anderson sampler에 항진균제 베노밀(benomyl)을 100ppm 농도로 첨가한 TSA (Tryptic soy agar, Oxoid, UK)를 장착 후, 흡입 유량 28.8L/min 으로 1분씩 각각 3반복으로 측정하였다. 측정한 배지는 외부의 공기로부터 오염을 차단하기 위해 파라필 름(parafilm)으로 밀봉한 후 25°C 배양기에 3일간 배양하였다. 배양 후 자란 세균은 균총계수기로 계수하 고 부유세균의 농도(CFU/m3)를 계산하였다.
2.2 세균 분리 및 분자유전학적 분석
공기 측정시 포집한 배지에서 자란 세균을 대상으로 균총의 색, 모양, 점성 등 형태를 관찰하여 서로 다른 모양의 균총을 선별한 후 TSA 배지에 획선으로 접종하고 25°C 배양기에 2일 배양 후 순수분리를 진행하였다. 고체배지에 순수분리한 세균은 단일 균총을 따서 TSB (Tryptic Soy Broth, Oxoid, UK) 20 mL에 접종하고 25°C 암조건에서 회전배양기로 24시간 배양 하였다. 배양한 세균의 분자적 동정을 하기 위해서 Direct DNA prep kit (NaviBiotech, Cheonan, Korea)를 사용 하여 세균의 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA 를 주형으로 하여 16S rDNA 특이적 Universal primer 인 27F (5'-AGAGTT TGATYMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTAC CTTGTTACGACT-3')로 유전자의 서열을 증폭하고자 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, RCR)을 BIo-Rad T100 Thermal cycler 를 이용하여 수행하였다(Lane, 1991;Hou et al., 2018). PCR 증폭산물은 DNA 증폭 유무와 기대하는 DNA의 크기를 확인하고자 1% agarose gel 전기영동을 통해 DNA 밴드를 확인하였다(Kwon et al., 2015a). DNA 밴드가 확인된 PCR 증폭산물은 High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 정제한 후 Macrogen 사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다.
2.3 분자계통분류학적 분석
결정된 염기서열은 EziBioCloud (https://www.ezbiocloud. net/) 데이터 베이스를 사용하여 염기서열 유사도가 높은 종들을 확인하였다. 세균의 계통분류학적 분석을 하기 위해 MEGA 11 프로그램의 CLUSTAL W alignment tool을 사용하여 분석대상 종들의 다중염기 서열정렬을 수행하였다(Tamura et al., 2021). 분자계 통수는 정렬된 서열을 이용하여 MEGA11 프로그램에서 Maximum Likelihood (ML) 방법으로 작성하였다 (Felsenstein, 1998, Tamura et al., 2021). 계통수 가지의 신뢰도는 1,000번 bootstrap resampling 분석으로 평가 하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 버섯 재배사 실내 온도 및 습도 조사
2022년 4월과 5월에 27°C로 설정된 느타리 재배사에서 측정된 실내온도는 각각 26.4°C, 23.9°C로 설정된 온도보다 다소 낮았다(Fig. 2). 5월의 경우 3.1°C 정도 낮게 측정되었다. 2022년 7월과 8월에 28°C로 설정 된 밀키버섯과 신령버섯 재배사에서 측정된 실내온도는 각각 28.3°C, 28.2°C로 설정온도 범위 내에 측정되었다. 2023년 6월, 7월, 8월에 각각 29°C로 설정된 밀키 버섯, 산느타리, 여름느타리를 같이 재배하는 재배사에서 측정된 실내온도는 29.9°C, 27.3°C과 31.0°C로 6 월은 설정온도 범위 내 측정되었지만 7월은 설정온도보다 1.7°C 정도 낮게 측정되고 8월은 설정온도보다 2°C 정도 높게 측정되었다(Fig. 2).
조사한 모든 버섯 재배사의 실내 습도는 60~99% 범 위로 설정되어 있었다. 2022년 4월과 5월 느타리 재배사의 실내 습도는 각각 47.5%, 57.8%로 설정된 습도 범위보다 낮게 측정되었다(Fig. 3). 2022년 7월과 8월의 밀키버섯과 신령버섯 재배사의 실내습도는 각각 80.8%, 81.7%로서 설정된 습도 범위 내로 측정되었다. 2023년 6월, 7월, 8월에 밀키버섯, 산느타리와 여름느타리 혼합 재배사의 실내습도는 각각 82.5%, 82.8%, 76.0%로 설정된 습도 범위 내로 측정되었다(Fig. 3).
3.2 버섯 재배사 실내 공기 중 부유세균 농도
2022년 느타리 재배사에서 부유세균을 측정한 결과, 4월은 5.27 × 103 CFU/m3이고 5월은 TNTC (Too Numerous To Count, >105CFU/m3)가 측정되었다(Fig. 4). 밀키버섯과 신령버섯 재배사는 7월에 1.37 × 103 CFU/m3이고 8월에 3.81 × 102 CFU/m3으로 측정되었다. 2023년 밀키버섯, 산느타리와 여름느타리 재배사는 6월에 5.79 × 102 CFU/m3, 7월에 4.98 × 102 CFU/ m3 이고 8월에 2.55 × 102 CFU/m3으로 측정되었다(Fig. 4). 부유세균의 환경부 다중이용시설 실내공기질 유지기준치 8 × 102 CFU/m3에 비교하였을 때 4월과 5월에 느타리버섯 재배사와 7월에 밀키버섯과 신령버섯 재배사는 기준치를 초과하였다. 3곳의 재배사 중 느타리 재배사에서 부유세균 농도가 가장 높았다. 특히 느타리 재배사의 4월 부유세균 농도는 기준치보다 6.58 배 초과하였고 5월의 경우 최소 125배이상 초과하였다. 이전에도 서로 다른 온도에서 느타리 재배사의 부 유세균 농도를 측정한 결과 20°C와 25°C에서 가장 농도가 높았던 보고가 있다(Jung et al., 2022). 평균온도 가 25.1°C인 느타리 재배사는 다른 버섯 재배사에 비해 4월과 5월의 평균 습도가 52.65%로 상대적으로 낮지만 적절한 온도조건에 의해 부유세균의 농도가 높았다고 판단된다. 밀키버섯과 신령버섯 재배사와 밀키버섯, 산느타리와 여름느타리 재배사는 7월 밀키버섯과 신령버섯 재배사 조사를 제외하곤 모두 유지기 준치보다 낮게 나왔다. 그러나 평균 습도가 80% 정도로 높기 때문에 재배사의 부유세균 오염도가 증가할 가능성이 있다. 따라서 고온과 습도가 높은 버섯 재배사는 공기질 관리에 신경을 써야할 것으로 사료된다.
3.3 부유세균의 동정 및 특성
Anderson sampler로 포집된 부유세균은 획선평판 법으로 순수분리하여 세균의 균총 형태를 확인하였다(Figs. 5, 6). 세균의 바코드 유전자인 16S rDNA를 이용해 순수분리된 세균을 동정한 결과, 3곳의 재배사로부터 총 23속 37종이 동정되었다(Table 1). 3곳의 재배사에서 동정된 세균에 대해 16S rRNA 염기서열을 기반으로 분자적 계통수를 작성한 결과, Bacilli강에서 20종, Gammaproteobacteria강에서 8종, Actinomycetia 강에서 3종, Alphaproteobacteria강에서 2종, Betaproteobacteria강에서 1종, Flavobacteriia강에서 1종, Sphingobacteriia강에서 1종으로 Bacilli강이 가장 많았다(Fig. 7). 동정된 세균을 속과 종 수준에서 볼 때, 2022년 조사된 느타리 재배사에서는 12속 18종이 나타났고 Bacillus 속에 속하는 종이 가장 많이 분리되었다. 밀 키버섯과 신령버섯 재배사는 4속 4종이 모두 서로 다른 속이 분리되었다. 2023년 조사된 밀키버섯, 산느타리, 여름느타리 재배사에서는 11속 18종이 분리되었 고 이중에 다시 Bacillus 속에 속하는 종이 가장 많이 분리되었다(Table 1). Priestia megaterium 종은 3곳 재 배사에서 공통으로 분리되었다.
동정된 세균 중에는 버섯 유해균, 인체병원균과 식중독균이 포함되어 있었다. Cedecea neteri는 산느타리 에 Yellow Rot disease, 나도팽나무버섯에 무름병(Soft rot disease)과 팽이버섯에 Yellow Sticky disease를 각각 유발하여 버섯 재배에 피해를 줄 수 있는 버섯 유해균이면서(Yan et al., 2018;Yan et al., 2019;Liu et al., 2021) 균혈증을 일으키는 인체병원균으로 보고되어 있다(Aguilera et al., 1995). Sphingobacterium kitahiroshimense와 Exiguobacterium acetylicum도 균혈증 유발한다는 보고가 있다(Keynan et al., 2007;Koh et al., 2013). Brevundimonas diminuta는 균혈증과 복막염을 유발한다(Pasadakis et al., 1993;Han and Andrade, 2005). Comamonas testosteroni는 화농성 수막염과 복막염을 유발한다는 보고가 있다(Arda et al., 2003;Duran et al., 2015). Raoultella terrigena는 폐혈증과 심내막염을 유발한다(Elamreen, 2007;Goegele et al., 2007). Myroides odoratus는 근막염, 봉와직염, 균혈증을 일으킨 보고가 있다(Green et al., 2001;Crum- Cianflone et al., 2014). Bacillus licheniformis는 균혈증을 일으키는 인체병원균이면서 식품을 오염시키는 식중독균인 보고가 있다(Blue et al., 1995;Nieminen et al., 2007). Bacillus cereus는 식중독을 일으킨다고 알려 져 있다(Schoeni and Wong, 2005;Nieminen et al., 2007).
4. 결 론
본 연구는 2022년부터 2023년까지 여름철 3곳의 버섯 재배사의 실내 온도, 습도, 부유세균 농도와 어떤 세균이 존재하는지 자료를 도출하였다. 조사된 재배 사간에 공기 중 세균 농도에 차이가 있었다. 환경부 다중이용시설 유지기준을 넘어서는 조건은 세균에 의한 공기 오염도가 높은 조건으로 볼 수 있다. 느타리와 신령버섯과 달리 밀키버섯, 산느타리와 여름느 타리는 아직 널리 재배되는 버섯은 아니다. 그러나 점차 국내의 기후가 온난화 되어 가는 추세에서 고온성 버섯 재배 작목의 선택이 필요한 상황인바 본 연구 결과는 이들 버섯의 재배 환경에서 발생할 수 있는 세균에 대한 새로운 정보로 유용하다. 특히 인체 유해성으로서 감염과 식중독 관련 세균 종의 존재가 확인 된 바 재배사의 위생관리가 필요함을 알 수 있다. 더불어 여름철 고온 조건에서 유해 세균의 농도가 증가 하지 않도록 재배사의 실내공기질을 관리하는 방법에 대한 연구가 진행되어야 할 것이다.
