1. 서 론
버섯은 탄수화물, 단백질, 식이섬유, 비타민 등이 풍부하고 약학적 가치가 있어 식용이나 약용으로 많이 이용되고 있다(Bano et al., 1988). Pleurotus 속의 버섯은 전 세계의 버섯 생산량 중 25%를 차지하며 많이 활용되는 식품이다(Knop et al., 2015). 느타리(P. ostreatus), 산느타리(P. pulmonarius), 여름느타리(P. sajor-caju), 사철느타리(P. florida), 전복느타리(P. abalonus) 등의 다양한 느타리가 농가에서 산업적으로 재배되고 있다(Lee et al., 2016). 밀키버섯(Milky with mushroom)이라고 알려진 식용버섯 Calocybe indica는 습한 아열대 지역인 인도가 원산지인 버섯이다. 밀키버섯은 배양조건이 30~32°C이기 때문에 유망한 고온성 버섯이다(Purkayastha and Chandra, 1976;Min et al., 2020). 신령버섯(Agaricus blazei)은 열대기후 인 브라질이 원산지로 항종양 활성을 띠고 있어 암 예방과 당뇨병, 동맥경화증 등 다른 질병의 민간요법으로도 쓰인 인기 있는 약용 버섯이다(Mizuno et al., 1990;Wasser and Weis, 1999).
최근 기후변화는 기후온난화로 인해 최근 30년의 기온이 20세기 초보다 1.4°C 정도 상승하였고 덥고 습한 여름기간이 더 길어지고 더 빨리 찾아온다고 보고 되었다(NIMS, 2018). 버섯 재배는 설정된 온도 및 습도를 유지 관리하며 이루어지는데 국내의 경우 주로 비닐하우스 형태의 재배사에서 생산하고 있다(Ahn and Lee, 2016). 여름철에 버섯 재배사의 외기 온도 상승 및 고온 일 수가 증가하면 온도 조건이 민감한 버섯은 생육이 억제되고 기형이 발생하고 품질이 저하 된다. 또한 버섯을 재배하기 위한 일정한 온도 및 높은 습도조건은 재배사 내 부유 진균의 농도 증가와 다양한 진균이 생장할 수 있는 환경을 제공한다. 부유진균은 인체의 건강에 영향을 주는 것 이외에도 버섯 재배용 배지를 오염시켜 잡균의 번식을 유도하거나 직접 버섯균의 생육을 억제시키거나 가해하여 버섯 생산에 피해를 준다(Tian et al., 2017). 표고 재배사 21 곳의 부유진균 농도를 조사할 때, 21곳 중에 20곳이 국내 환경부 다중이용시설 실내공기질 권고 기준치 500 CFU/m3을 초과하였고 진균의 생물상 조사 결과 버섯 유해균이나 인체병원균이 검출되었다(Kim et al., 2018). 양송이 재배사에서도 실내 공기에 존재하는 부유진균을 조사한 결과 인체병원균과 식중독균이 검출된 보고가 있다(Kwon et al., 2014). 이렇듯 재배사내의 부유진균은 우리의 건강과 농업에 악영향을 줄 수 있기 때문에 재배사의 실내공기 중 부유진균의 오염도와 미생물상을 파악하는 것은 재배사 위생 관리에 중요한 사항이다. 그러나 아직까지 다양한 버섯 재배사와 고온과 같은 환경에서 부유진균의 오염도가 어느 정도 인지, 어떠한 진균이 분포하는지에 대한 연구는 많이 되어 있지 않다. 특히 국내에는 밀키버섯, 신령버섯과 여러가지 느타리 종을 재배하는 재배사의 실내 공기질 조사가 이루어져 있지 않고 특히 여름철 같이 기온이 높은 환경에서 고온성 버섯 재배를 하는 버섯 재배사의 실내 공기질에 대한 자료가 부족한 실정이다.
본 연구는 2년간 국내 밀키버섯, 신령버섯, 느타리 버섯 품종들을 재배하고 있는 재배사를 대상으로 부유진균 농도와 미생물상을 조사하여 버섯 재배사의 실내공기질 관리를 위한 기초 자료를 얻기 위하여 수행되었다.
2. 재료 및 방법
2.1 버섯 재배사 온도, 습도 및 부유진균 측정
버섯 재배사는 충청북도 충주시에 위치한 관수와 가습처리 시설이 있고 차광막과 3중피복으로 구성된 비닐하우스 재배사에서 부유진균 농도를 측정하였다. 측정시기는 2022년부터 2023년까지 기간 중 여름철에 버섯 재배사를 방문하여 각 버섯의 재배기간 중 한 달에 한번 부유진균을 측정하였다.
버섯 재배사는 느타리 재배사, 밀키버섯과 신령버섯 혼합재배사, 밀키버섯, 산느타리, 여름느타리 혼합 재배사 등 3가지 유형의 재배사를 대상으로 조사하 였다. 느타리 재배사의 경우 농가의 재배상황에 따라 2022년 4월과 5월에 측정하였다. 밀키버섯과 신령버섯 혼합재배사에서는 2023년 7월과 8월에 측정하였다. 밀키버섯, 산느타리, 여름느타리 혼합재배사에서는 2023년 6월, 7월, 8월에 각각 측정하였다. 재배사의 온도 및 습도는 Testo (Testo 625, Testo AG, Germany) 측정기를 이용하여 측정하였다. 버섯 재배사의 부유진균 측정은 실내공기질 공정시험법에 따라 Anderson sampler (Al -Doory, 1970)을 사용하여 충돌법으로 측정하였다. Anderson sampler는 재배사 내 중앙지점에 서 바닥으로부터 1.2 미터 높이에서 삼각지지대에 거치하여 사용하였다(Fig. 1). 측정기기에는 DG18 (Dichloran- Glycerol 18%, MBcell, Seoul, Korea) 배지를 장착한 후, 28.8L/min의 흡입 유량으로 1분간 3회 측정하였다. 측정한 배지는 외부의 공기로부터 오염을 방지하기 위해 파라필름(parafilm)으로 밀봉한 후 쿨러에 담아 실험실로 운반하였다. 25°C 배양기에 3~5 일간 배양하였다. 배양 후 자라난 균총을 균총계수기 로 계수하고 1,000 L (m3) 당 공기 중 부유진균의 농도 (CFU/m3)를 계산하였다.
2.2 진균 분리 및 마커 유전자 염기서열 분석
배지에서 자란 균총의 형태가 다르게 보이는 균사체를 멸균된 접종 핀을 사용하여 새로운 PDA (Potato Dextrose Agar, Difco, Detroit, MI, USA)에 접종하고 25°C 암조건의 배양기에서 5일 동안 배양하였다. 포자가 형성된 균은 단포자를 분리하여 접종해서 25°C 암조건의 배양기에서 7일 배양하였다. 순수분리한 진균은 분자적 동정을 하기 위해 Direct DNA prep kit (NaviBiotech, Cheonan, Korea)를 사용하여 회사에서 제공한 실험법에 따라 배지위에 자라나온 균사를 취하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출한 DNA를 주형으로 하여 internal transcribed spacer (ITS) region (ITS1-5.8s-ITS2), 28S large subunit of nuclear ribosomal RNA gene (28S LSU rDNA), partial β-tubulin gene (BenA), partial calmodulin gene (CaM) 서열을 Bio- Rad T100 Thermal cycler을 통해 증폭하였다. 각 서열을 증폭하기 위한 PCR 조건은 Table 1에 제시하였다. PCR 증폭산물은 1% Agarose gel 전기영동을 통해 DNA 증폭 유무와 기대하는 DNA의 크기를 확인하였다(Kwon et al., 2015). DNA 밴드가 확인된 PCR 증폭산물은 High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 DNA를 정제하고나서 Macrogen Corp. (Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서 열을 분석하였다.
2.3 분자계통학적 분석
결정된 마커 유전자의 염기서열은 GenBank BLASTN 을 사용하여 National Center for Biotechnology Information (NCBI, 2023) 데이터베이스에 있는 균류의 마커 유전자 서열과 상동성을 비교 분석하였다. 분자계 통학적 분석은 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) MEGA 11 CLUSTAL W alignment tool을 사용하여 대상 종의 다중염기서열정렬을 수행하였다(Tamura et al., 2021). 정렬된 염기서열은 비교 진균 간의 유연관계를 파악하기 위해 MEGA11 프로그램에서 Maximum Likelihood (ML) 방법으로 계통수를 분석하였다. 계통 수의 가지분지 신뢰도는 1,000번 bootstrap resampling 분석으로 평가하였다(Felsenstein, 1998, Tamura et al., 2021).
3. 결과 및 고찰
3.1 버섯 재배사 실내 공기 중 부유진균 농도
2022년 4월과 5월 느타리버섯 재배사 실내의 총 부유진균을 측정한 결과 2.95 × 102CFU/m3, TNTC (Too Numerous To Count, >105CFU/m3)로 각각 측정되었 다(Fig. 2). 2022년 7월과 8월 밀키버섯과 신령버섯 재배사는 모두 TNTC로 측정되었다. 2023년 6월부터 8월까지 밀키버섯, 산느타리와 여름느타리 재배사는 7.45 × 103 CFU/m3, 9.17 × 103CFU/m3, 1.12 × 103CFU/ m3로 측정되었다. 환경부의 다중이용시설 실내공기 질관리법 내 곰팡이 관리기준치 5 × 102CFU/m3에 비교하면 4월 느타리버섯 재배사를 제외하고 모든 재배사가 유지 기준치를 초과하였다. 5월 느타리버섯 재 배사와 밀키버섯 신령버섯 재배사의 총부유진균 농 도는 최소 200배 이상 높았다. 밀키버섯, 산느타리와 여름느타리 재배사는 6월에 14.9배, 7월에 18.3배, 8월 에 2.2배 높았다. 느타리 재배사의 총부유진균 농도조사를 보면 한 달사이에도 진균 농도가 급변할 수 있음을 보여준다. 3곳의 재배사의 평균 온도는 각각 25.1°C, 28.3°C, 29.4°C이고 평균 습도는 52.65%, 81.25%, 80.43% 로 재배사의 실내공기 조건은 공기중의 부유진균이 생장하기 좋은 조건이기 때문에 총부유진균 농도가 높게 측정되었다고 사료된다. 이전에도 표고버섯 재배사에서 부유진균 농도를 조사했을 때 21곳의 재배사 중 20개의 재배사가 실내공기질 권고기준을 초과 하였다(Kim et al., 2018). 본 연구는 이러한 이전이 보고와 같이 버섯 재배사내 실내공기 중 진균오염도가 상당히 높음을 보여준다. 이는 부유진균이 재배중인 버섯의 생육과 재배자의 건강에 영향을 미칠 가능성이 높게 한다.
3.2 부유진균의 동정 및 특성
공기를 포집한 배지에서 순수분리한 진균은 균총의 형태를 관찰하여 확인하였다(Figs. 3, 4). 진균의 marker 유전자 서열로서 ITS, LSU rDNA, BenA gene, CaM gene을 이용하여 진균을 분류 동정한 결과, 3곳 의 재배사에서 진균은 총 8속 22종이 분리되었다(Table 2). 느타리 재배사에서는 5속 7종, 밀키버섯과 신령버섯 재배사에서는 4속 6종, 밀키버섯, 산느타리와 여름 느타리 재배사에서는 5속 15종이 분리되었다. 3곳의 버섯 재배사에서 동정된 진균에 대한 ITS region을 기반으로 분자적 계통수를 작성할 때, Eurotiomycetes 강에서 14종, Dothideomycetes강에서 3종, Mucoromycetes강에서 3종, Leotiomycetes강에서 1종, Sodariomycetes강에서 1종 분류되었고 Eurotiomycetes 강이 가장 많이 차지하였다(Fig. 5). 속(Genus) 수준에서 볼 때, Aspergillus 속이 8종으로 가장 많았고 Aspergillus flavus 는 3곳의 재배사에서 공통적으로 분리되었다.
동정된 진균 중 버섯 유해균, 식중독균과 인체병원균이 포함되어 있었다(Table 2). Penicillium brevicompactum는 푸른곰팡이병을 일으켜 버섯 재배에 피해를 줄 수 있다(Tian et al., 2017). Aspergillus ochraceus, A. flavus, A. westerdijkiae, Penicillium citrinum와 P. steckii는 곰팡이 독소를 생산하여 식품을 오염시킬 수 있는 식중독균으로 보고되어 있다(Trenk et al., 1971;Davis et al., 1975;Gourama and Bullerman, 1995;Rundberget et al., 2004;Gil-Serna et al., 2015). A. ochraceus, A. flavus, A. fumigatus는 아스페르길루스증 (Aspergillosis)을 일으키는 인체병원균으로도 알려져 있다(Novey and Wells, 1978;Denning, 1998;Latge, 1999). A. sydowii는 조갑진균증(Onychomycosis) 일으 키는 인체병원균으로 보고되고 있다(Borgohain et al., 2019). A. tubingensis는 심내막염(Endocarditis)을 일으킨 사례가 있다(Born et al., 2022). Cladosporium halotolerans 는 곰팡이혈증(Fungemia)과 피부접합진균증(Cutaneous zygomycosis)을 일으킨 보고가 있다(Dizbay et al., 2009). Parengyodontium album는 사람 피부에 Cutaneous hyalohyphomycosis을 일으킨 보고가 있다(Tsang et al., 2016). Syncephalastrum monosporum는 모균증(Mucormycosis) 유발한 보고가 있다(Singh et al., 2021).
4. 결 론
본 연구는 2022년부터 2023년까지 2년간 여름철 3 곳의 버섯 재배사를 방문하여 실내 부유진균 농도와 분포하는 진균의 종을 파악하였다. 느타리 재배사의 경우 부유진균 농도는 4월과 5월의 차이가 크기 때문에 부유진균 농도는 봄에도 상당히 높을 수 있음을 알 수 있었다. 밀키버섯과 신령버섯 재배사와 밀키버섯, 산느타리, 여름느타리 재배사에서도 6월과 7월 8월 모두 실내공기질 권고기준치를 초과하였다. 이는 25°C 이상의 고온 조건에서 재배되는 환경에 부유진균 농도가 매우 높음을 보여준다. 따라서 여름철 재배사의 실내공기 중 진균 오염도 관리가 필요하다. 3곳의 버섯 재배사 내 부유 진균으로부터 분리된 진균은 22종으로 분류 강(Class) 수준에서 포자 형성이 뛰어난 Eurotiomycetes 강이 14종으로 가장 많음을 알 수 있었다. 특히 버섯에 피해를 주는 유해균과 식품 및 인체에 영향일 미치는 균이 여기에 포함되어 있어 공기중 의 진균의 양적 오염도뿐만 아니라 질적 요소도 중요함을 알 수 있다. 특히 Aspergillus 속은 고온 조건에서 재배하는 버섯 재배사의 부유진균 중 가장 많이 나온 분류군이었고 특히 식중독인 A. flavus가 모든 재배사에서 분리되었기 때문에 버섯 재배사 위생관리에 있어서 유의할 필요가 있다. 이상의 결과는 버섯 재배 사에서 실내 공기 속 부유 진균의 농도와 더불어 미생물상에 대한 유용한 정보를 제공한다.
