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ISSN : 2288-9167(Print)
ISSN : 2288-923X(Online)
Journal of Odor and Indoor Environment Vol.23 No.3 pp.197-206
DOI : https://doi.org/10.15250/joie.2024.23.3.197

Effects of key particulate matter components (PAHs, trace elements, and Ions) on the physiology of human airway epithelial cells (Calu-3)

Tae Eun Kim, Jun Woo Lim, Jae Hyun Jeong*, Hee Wook Ryu**
Department of Chemical Engineering, Soongsil University
* Corresponding Author: Tel: +82-2-820-0611 E-mail: hwryu@ssu.ac.kr
** Corresponding Author: Tel: +82-2-828-7043 E-mail: nfejjh@ssu.ac.kr
10/09/2024 24/09/2024 24/09/2024

Abstract


Health concerns related to particulate matter (PM) pollution are on the rise globally. This study investigates the effects of the main components of PM on human airway epithelial cells (Calu-3), focusing on three distinct types: PM10-bound PAHs (including Benzo[a]anthracene and Benzo[b]fluoranthene), PM10-bound trace elements (containing arsenic and lead), and PM2.5-bound ions (comprising sodium and calcium). Calu-3 cells were exposed to these PM components at concentrations ranging from 2 to 100 μg/mL. Unexposed Calu-3 cells exhibited a 60% increase in metabolic activity after 12 hours. In contrast, exposure to PM components resulted in significant reductions in cell viability, with PM10-bound PAHs and PM10-bound trace elements causing decreases of 54% and 55% respectively, and PM2.5-bound ions leading to a 63% reduction at 100 μg/mL. Additionally, there was found to be a notable rise in the expression of proinflammatory cytokines IL-8 and TNF-α. Specifically, IL-8 levels increased by 456%, and TNF-α levels rose by 660% after 12 hours of exposure to PM2.5-bound ions. These findings indicate that the size and composition of fine dust particles play a critical role in their cytotoxic effects, contributing to increased cell death, membrane damage, and necrosis in airway epithelial cells.


Calu-3 , Cytotoxic , Health Risk Assessment , Particulate matter

미세 먼지 주요 성분인 PAHs, Trace Elements, Ions이 인간 기도 상피세포 (Calu-3) 생리에 미치는 영향

김태은, 임준우, 정재현*, 류희욱**
숭실대학교 화학공학과

초록

    © Korean Society of Odor Research and Engineering & Korean Society for Indoor Environment. All rights reserved.

    1. 서 론

    대기 중 미세 먼지 오염은 환경과 인체 건강에 점점 더 심각한 위협이 되고 있다(Shaddick et al., 2020). 대기 중에 부유하는 미세 먼지 입자는 호흡기를 통해 신체 내부로 침투하여 인체 건강에 직접적인 악영향을 미친다(Pope et al., 2011;Hamra Ghassan et al., 2014;Fitoussi et al., 2022). 다양한 연구에서 미세 먼지가 여러 인체 장기에 미치는 악영향이 보고되고 있지만 (Glencross et al., 2020), 미세 먼지 각 성분이 건강에 미치는 영향에 대한 개별적인 평가는 아직 부족하다. 미세 먼지 노출은 산화 스트레스와 염증 반응을 유발해 인체 조직을 손상시킬 수 있으며, 특히 상부 호흡기에 영향을 미쳐 천식 및 심혈관 질환의 발병 위험을 증가시킨다(Valavanidis et al., 2013;Zaręba et al., 2024). 또한, 미세 먼지에는 활성 산소종(ROS)을 생성할 수 있는 성분이 포함되어 있으며, 이들은 산화 활성에 중요한 역할을 하여 건강에 잠재적인 악영향을 미친다(Lin et al., 2022;Valavanidis, 2019).

    PM2.5(입자 지름 2.5 μm 이하)와 PM10(입자 지름 10 μm 이하)은 유기 및 무기 화합물의 복잡한 혼합물로, 다환방향족탄화수소(PAHs), 미량 금속 및 이온을 포함한다(Valavanidis et al., 2008;Kelly and Fussell, 2012). 미세 먼지의 조성은 전 세계적으로 발생원과 지역에 따라 다르게 나타나며, 광물성 먼지, 차량 배기가스, 산업 배출물, 바이오매스 연소 등이 미세 먼지의 주요 구성 성분에 기여한다(Shaltout et al., 2020;Reizer et al., 2021). 계절적 변화나 사막 먼지의 이동 또한 미세 먼지의 구성에 영향을 미친다(Han et al., 2005;Middleton, 2017). 이러한 미세 먼지의 각 성분을 이해하는 것은 대 기질과 오염원을 식별하고, 미세 먼지 노출에 따른 건강 영향을 평가하는 데 중요하다. 이러한 미세 먼지는 일반적으로 호흡기를 통해 체내로 흡입되며, 인체의 첫 번째 방어선인 기도 상피에 직접적으로 영향을 미친다. 따라서, 기도 상피세포는 미세 먼지 노출에 따른 인체 건강 영향 평가에서 중요한 역할을 한다. 특히, 상부 호흡기에 위치한 기도 상피세포는 흡입된 미세 먼지가 가장 먼저 접촉하는 세포로, 그 생리적 반응을 분석하는 것이 필수적이다. 인간 기도 상피세포인 Calu-3 세포는 기관지 상피의 대표적인 모델로서, 이러한 미세 먼지의 영향을 직접적으로 반영할 수 있는 중요한 연구 대상으로 널리 활용된다(Kreft et al., 2015).

    따라서 본 연구는 미세 먼지의 주요 성분이 인간 기도 상피세포인 Calu-3 세포에 미치는 생리적 반응을 분석하고, 미세 먼지 각 성분에 의한 건강 영향 평가의 이해 격차를 해소하는 것을 목표로 한다. 본 연구에서는 다양한 성분 조건을 시뮬레이션한 미세 먼지 모델 화합물을 사용하여 Calu-3 세포의 대사 활동과 염증성 사이토카인 발현을 분석하였다. 미세 먼지에 노출된 세포의 생존율 감소와 염증성 반응 증가는 미세 먼지와 건강 영향 사이의 복잡한 상호작용을 이해하는 데 중요한 통찰력을 제공한다. 특히, 본 연구는 PM2.5-Ions이 Calu-3 세포에 강한 세포 독성을 유발하며, 세포 생존율의 현저한 감소와 염증성 사이토카인의 발현 증가는 Calu-3 세포가 미세 먼지에 매우 민감하다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 미세먼지 노출이 인체 건강에 미치는 잠재적인 위험성을 강조한다. 환경 보건 분야가 확장됨에 따라, 본 연구는 미세 먼지 노출이 인간 세포에 미치는 생리적 복잡성을 밝히는 데 중요한 기여를 할 것이며, 환경 보건 평가에서 미세 먼지 성분별 고려가 필요함을 시사한다.

    2. 실험 방법

    2.1 미세 먼지 모델 화합물 준비와 처리

    미세 먼지는 입자 크기에 따라 직경 2.5 μm 이하인 PM2.5와 직경 10 μm 이하인 PM10으로 구분된다. 미세 먼지는 다환방향족탄화수소(PAHs, polycyclic aromatic hydrocarbons), 미량 원소, 이온, 전이 금속, 생물학적 성분 등 다양한 화학적 및 물리적 성분으로 구성된다. 본 연구에서는 PM2.5-Ions (ERM-CZ110, Sigma-Aldrich, MO, USA), PM10-PAHs (ERM-CZ100, Sigma-Aldrich, MO, USA), 그리고 PM10-Trace elements (ERM-CZ120, Sigma-Aldrich, MO, USA)를 사용하여 미세 먼지 성분의 영향을 평가하였다. 미세 먼지는 자외선(UV) 하에서 30분간 멸균한 후, 1X 인산 완충식염수(PBS, Biowest, France)에 500 μg/mL 농도로 분산시켰다. 이후 1시간 동안 초음파 처리한 후 이 미세 먼지 원액을 세포 배양 배지에 희석하였다. 미세 먼지 용액 최종 농도는 예비 실험을 통해 미세 먼지 독성이 세포 생리에 미치는 영향을 뚜렷하게 파악할 수 있는 범위로 결정하였다. 50 및 100 μg/mL 농도의 고농도는 오염이 심한 환경에서 급성 또는 만성 노출에 의한 세포 독성 효과 메커니즘을 평가할 목적으로 적용 하였다. 2 및 10 μg/mL의 보다 낮은 농도는 적당한 노출 수준에서 세포 반응을 이해할 수 있다. 세포에 처리한 미세 먼지 용액은 최종 농도 2, 10, 50, 100 μg/mL로 사용하였다. 각 성분의 구성은 Table 1 - 3에 상세히 설명되어 있다.

    2.2 인간 기도 상피세포(Calu-3) 배양

    Calu-3 세포(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)는 75 cm2 세포 배양 플라스크에서 10% 소 태아 혈청(FBS, Thermo Fisher Scientific, USA), 1% penicillinstreptomycin (P/S, 100x, Biowest, France)이 포함된 Dulbecco’s Modified Eagle’s 배지(DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 배양하였다. 세포는 5% CO₂, 37°C의 환경에서 배양하며, 이틀에 한 번 배양 배지를 교체하였다. 세포 성장이 80%에 도달했을 때 0.25% Trypsin(Biowest, France)을 사용하여 플라스크에 부착된 세포를 분리하였으며, 실험 동안 광학현미경(Nikon Eclipse TS100, Japan)을 사용해 관찰하였다.

    2.3 세포 생존율 분석

    미세 먼지가 인간 세포에 미치는 독성 효과를 평가하기 위해 MTT assay를 사용하여 광학 밀도(OD, optical density)로 세포 생존율을 측정 후 분석하였다. Calu-3 세포는 96-well plate에 1.0 × 105 cells/well 농도로 접종하였고, 3시간 후 세포가 안정화되면 미세 먼지를 처리하였다. 미세 먼지는 2, 10, 50, 100 μg/mL 농도로 세포 성장 배지에 희석한 후, 5% CO2, 37°C 환경 에서 6, 12, 24, 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 미세 먼지가 포함된 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척하였다. PBS로 세척한 각 well에 5 mg/mL 농도의 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Thermo Fisher, USA) 용액을 10% (v/v)로 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 배양 후, 50% (w/v) N,N-dimethylformamide (DMF)와 10% (w/v) SDS가 포함된 용해 완충액을 추가하고, 형성된 포르마잔을 암실에서 2시간 동안 용해하였다. 이후 마이크로플레이트 판독기(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용해 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 샘플의 흡광도 값에서 MTT 용액이 포함된 배지의 흡광도를 제외하고 결과를 분석하였다.

    2.4 염증성 사이토카인 측정

    미세 먼지에 의한 Calu-3 세포의 염증 반응을 평가하기 위해 염증성 사이토카인인 Interleukin 8(IL-8) 과 Tumor necrosis factor-α (TNF-α)의 발현 수준을 측정하였다. Calu-3 세포를 5.0 × 105 cells/mL 농도로 48- well plate에 접종한 후, 미세 먼지 각 성분을 2, 50 μg/ mL 농도로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 12시간 및 48시간 후 상층액을 수집하여 –40℃에서 보관하였다. 염증성 사이토카인은 Human IL-8 ELISA Kit (ab214030, Abcam, MA, USA) 및 Human TNF Alpha ELISA kit (ab181421, Abcam, MA, USA)를 사용하여 분석하였다. 수집한 상층액은 항체 용액과 혼합해 37°C 에서 2시간 동안 항체 플레이트에 배양되었다. 세척 용액으로 3회 세척한 후 기질 용액(TMBZ)을 첨가하고, 실온에서 20분간 반응시켰다. 반응 후 정지 용액을 첨가해 반응을 중단시킨 후, 마이크로플레이트 판독기를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 제조업체에서 제공한 프로토콜에 따라 실험을 진행하였으며, IL-8 및 TNF-α 표준 곡선을 사용하여 발현된 항체 양을 측정하였다.

    3. 결과 및 고찰

    3.1 미세 먼지 주요 성분이 세포 생존율에 미치는 영향

    미세 먼지가 인간 기도 상피세포(Calu-3)에 미치는 영향을 평가하기 위해, MTT assay를 통해 세포 생존율 및 대사 활동(metabolic activity)을 분석하였다. 96-well plate에서 배양된 Calu-3 세포를 관찰하면 전형적인 기도 상피세포에서 볼 수 있는 긴밀한 세포 간 연결(tight junctions)이 발달된 콜로니(colony) 형태를 이루는 것을 확인할 수 있다(Fig. 1). 장벽 기능을 수행하는 기관의 상피세포에서 볼 수 있는 형태라고 하겠다. 미세 먼지를 처리하지 않은 Calu-3 세포는 12시간 동안 대사 활동이 약 60% 증가하였으며, 이후 48시간까지 12%가 추가로 증가하여 시간이 지남에 따라 지속적인 대사 활성 증가를 확인할 수 있었다(Fig. 1). 이는 Calu-3 세포가 정상적인 환경에서 빠른 초기 성장과 더불어 시간이 지남에 따라 대사 활동이 점진적으로 증가하는 일관된 경향을 보인다는 것을 나타낸다.

    이렇게 대사 활동이 정상적인 인간 기도 상피세포에 미세 먼지의 각 성분(PM10-PAHs, PM10-Trace elements, PM2.5-Ions)을 2, 10, 50, 100 μg/mL 농도로 6, 12, 24, 48시간 동안 처리한 후, 각 대조군의 흡광도 값으로 세포 생존율을 정규화하였다. 미세 먼지에 노출된 Calu- 3 세포는 노출 시간이 길어질수록 세포 생존율이 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2). 이는 미세 먼지가 세포 성장을 저해시키는 것을 의미한다. 특히, PM10-PAHs와 PM10-Trace elements 성분에 100 μg/mL 농도로 48시간 동안 노출된 경우 세포 생존율이 각각 54%, 55% 감소하였고, PM2.5-Ions 성분에 동일한 농도로 노출된 경우 세포 생존율이 63% 감소하였다. 이는 미세 먼지의 입자 크기와 화학적 성분이 세포 독성에 중요한 영향을 미친다는 것을 시사한다(Thomson et al., 2015). 특히 PM2.5-Ions는 Na+, Ca2+ 등의 이온성 성분과 작은 입자 크기로 인해 더 큰 세포 독성을 나타냈음을 알 수 있다. 이는 미세 먼지의 불용성 분획이 세포 사멸과 세포막 손상을 유발한다는 이전 연구(Liu et al., 2020)와 일치하는 결과로, PM2.5-Ions가 인간 기도 세포에 심각한 물리적 손상을 유발했음을 알 수 있다. 또한 미세 먼지를 인간 피부세포인 진피세포(human dermal fibroblasts), 표피세포(keratinocytes)에 노출시켰을 때 보이는 세포 독성 결과와 비교한 경우, 적은 농도(2, 10 μg/mL)에서도 인간 기도 상피세포에서 약 2배 가량 세포 독성이 심한 것을 확인할 수 있었다. 이는 미세 먼지가 인간 기도 상피세포에 더 민감하게 작용한다는 것을 시사하며, 기도 상피세포가 미세 먼지에 의한 물리적 손상 및 세포 독성 반응에 있어 중요한 연구 대상으로 우선적으로 고려되어야 함을 보여준다.

    3.2 미세 먼지 장시간 노출에 의한 세포 생존율

    Calu-3 세포에 48시간 동안 미세 먼지를 노출한 후 세포 생존율을 평가한 결과, 모든 미세 먼지 성분에서 농도 의존적으로 세포 생존율이 감소하였다(Fig. 3). 2 μg/mL 농도로 노출된 Calu-3 세포의 생존율(normalized cell viability)은 대조군 대비 약 37% 감소하여 평균 0.63을 기록하였으며, 100 μg/mL 농도로 노출된 경우 대조군보다 약 57% 감소한 평균 0.42의 생존율을 보였다. 특히 PM2.5-Ions에 노출되었을 때 세포 생존율은 63% 감소한 0.36을 기록하여 가장 강한 세포 독성을 보였다. 이러한 결과는 미세 먼지에 의한 세포 독성이 농도와 노출 시간에 의존적이라는 점을 뒷받침하며(Akhtar et al., 2010;Yang et al., 2018), 이는 인체 건강에 미치는 미세 먼지의 유해한 영향을 의미한다. 미세 먼지 장시간 노출 시, 세포 독성은 세포 내 nitric oxide (NO) 생성과 관련이 있다고 보고되었다 (Marmolino and Manto, 2011). 미세 먼지 노출로 NO가 과잉 생성되면 세포 사멸로까지 이어진다(Huang et al., 2003). 나아가 5 μm 이하의 미세 먼지 입자는 폐포 섬유화를 유발하고 폐 기능을 저하시킬 수 있다(Lestari et al., 2023).

    3.3 미세 먼지 주요 성분에 의한 염증성 사이토카인 발현

    미세 먼지 입자는 TLR2 및 TLR4 수용체를 활성화 시켜 IL-8의 발현을 촉진하며( Shoenfelt et al., 2009;Gottipati et al., 2015;Meganathan et al., 2020), TNFR2 수용체를 매개로 TNF-α 발현을 유도한다(Jacobsen et al., 1996). IL-8은 폐에서 호중구를 유인하고 활성화하여 급성 폐 손상을 유발하며(Drumm et al., 1999), TNF-α는 미세 먼지 노출에 의해 폐 염증을 촉진하고 폐 섬유화와 관련이 깊다(Snoeck et al., 1996;Xie et al., 2020). 때문에 본 연구에서는 미세 먼지 노출에 의한 Calu-3 세포의 염증 반응을 평가하기 위해 IL-8과 TNF-α의 분비를 정량적으로 분석하였다(Fig. 4). 연구 결과, IL-8 발현량(Fig. 4a)은 미세 먼지 노출에 따라 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 특히, PM2.5-Ions 50 μg/mL 농도에 노출된 경우, 12시간 후 대조군 대비 456%, 48시간 후에는 89% 증가하였다. 이 수치는 미세 먼지의 성분 중 이온화된 물질이 기도 상피세포에서 강한 염증 반응을 유발하는 주요 원인임을 시사한다. IL-8은 호중구를 유인하여 폐 조직 손상을 유발할 수 있기 때문에, 미세 먼지에 의한 IL-8 발현 증가가 장기간 노출 시 심각한 호흡기 질환으로 이어질 수 있다는 점도 주목할 필요가 있다. TNF-α 분비량(Fig. 4b) 역시, 미세 먼지 노출에 의해 현저히 증가하였다. PM2.5-Ions 50 μg/mL 농도에서 TNF-α는 12시간 후 660%, 48시간 후 485% 증가한 것으로 확인되었다. 이러한 TNF-α 의 급격한 증가가 폐 염증과 조직 손상의 주요 원인으로 작용할 수 있으며, 이는 미세 먼지 성분이 염증성 사이토카인 경로를 활성화시켜 강력한 면역 반응을 유발함을 보여준다. 흥미롭게도, TNF-α 발현량은 12시간 후보다 48시간 후에 약 175% 감소한 것으로 나타났는데, 이는 고농도 PM2.5-Ions 노출로 세포 생존율이 급격히 감소한 결과로 볼 수 있다(Hetland et al., 2004). 이 현상은 세포가 극심한 염증 반응과 스트레스로 인해 생존율이 저하됨에 따라, TNF-α의 분비가 일정 시점 이후 감소할 수 있음을 시사한다. 따라서, 미세 먼지의 장기적 노출이 세포 생존율에 미치는 영향을 고려하여 염증 반응이 어떻게 변화하는지 평가하는 것이 중요하다.

    이러한 결과는 미세 먼지가 세포 사멸을 유도하고, 염증 반응과 염증성 사이토카인 발현을 활성화한다는 것을 의미한다. 특히 PM2.5-Ions가 가장 강한 염증 반응을 유도하여 세포 생존율 감소와 염증성 사이토카인의 높은 발현을 보여주었다. 이는 미세 먼지의 독성이 세포 독성과 염증 반응을 모두 유발하여 호흡기 건강에 악영 향을 미칠 수 있음을 시사한다(Huang et al., 2021). 결론적으로, 미세 먼지에 노출된 Calu-3 세포는 농도 의존적으로 생존율이 감소하며, 염증성 사이토카인의 발현이 증가함으로써 미세 먼지 성분의 독성이 세포 손상과 염증 반응을 유도한다는 것을 확인할 수 있다.

    4. 결 론

    본 연구는 미세 먼지가 기도 상피 세포주인 Calu-3 세포에 미치는 세포 독성과 염증 반응을 분석였다. MTT assay를 통해 미세 먼지의 다양한 농도와 성분에 노출된 Calu-3 세포의 생존율을 평가한 결과, 미세 먼지의 농도와 노출 시간이 증가할수록 세포 생존율이 감소하는 경향을 확인할 수 있었다. 특히 PM2.5-Ions 성분에 100 μg/mL 농도로 48시간 노출된 경우, 세포 생존율이 대조군에 비해 63% 감소하였으며, 이는 PM2.5- Ions의 작은 입자 크기와 독성 화학 성분이 세포에 심각한 손상을 일으킨다는 것을 시사한다. 장시간 미세 먼지 노출 실험에서도 미세 먼지의 농도와 노출 시간이 증가함에 따라 세포 생존율이 유의미하게 감소하였으며, PM2.5-Ions 성분이 특히 강한 세포 독성을 나타냈다. 또한 염증 반응 분석 결과, 미세 먼지 노출이 IL-8 및 TNF-α의 발현을 유도한다는 것을 확인하였다. 특히 PM2.5-Ions에 노출된 세포에서는 IL-8과 TNF-α의 발현이 대조군에 비해 크게 증가하였으며, 이는 세포 생존율 감소와 염증 반응의 활성화 사이의 밀접한 상관관계를 나타낸다. 결론적으로, 본 연구를 통해 미세 먼지가 Calu-3 세포의 생존율을 저해하고 염증성 사이토카인의 발현을 촉진하여 세포 독성을 유발함을 확인하였다. 이는 미세 먼지의 독성 효과가 인체 건강에 미치는 잠재적 위험성을 강조하며, 미세 먼지 노출을 줄이기 위한 대책 마련의 필요성을 시사한다.

    감사의 글

    This work was supported by the Ministry of Education (NRF–2020R1A6A1A03044977).

    <저자 정보>

    김태은(박사 과정 학생), 임준우(박사), 정재현(교수), 류희욱(교수)

    Figure

    JOIE-23-3-197_F1.gif

    Physiological Activity of Calu-3 Cells. (a) Metabolic activity of Calu-3 cells measured and normalized at each time point after stabilization in wells. (b) Images of cells cultured for 48 hours before MTT reagent treatment. (c) Images of cells cultured for 48 hours after MTT reagent treatment.

    JOIE-23-3-197_F2.gif

    Physiological Effects of Fine Dust Exposure on Calu-3 Cells. (a) Bright-field images of Calu-3 cells treated with 50 μg/mL of particulate matter (PM) before and after the MTT assay. (b-d) Cell viability of Calu-3 cells exposed to the main components of particulate matter: (b) PM10-PAHs, (c) PM10-Trace elements, and (d) PM2.5-Ions. Cell viability was measured over 48 hours after exposure to concentrations ranging from 2 to 100 μg/mL.

    JOIE-23-3-197_F3.gif

    Survival of Calu-3 Cells Exposed to Particulate Matter for Prolonged Periods. Calu-3 cells were exposed to the main components of particulate matter, PM10-PAHs, PM10-Trace elements, and PM2.5-Ions at concentrations of 2, 10, 50, and 100 μg/mL for 48 hours.

    JOIE-23-3-197_F4.gif

    Cytokine Expression Analysis in Calu-3 Cells Exposed to Particulate Matter. (a) IL-8 and (b) TNF-α expression in Calu-3 cells after exposure to the main components of particulate matter at concentrations of 2 and 50 μg/mL for 12 and 48 hours.

    Table

    Fine dust (PM10-like) (PAHs), ERM®, Certified reference material

    Fine dust (PM10-like) (trace elements), ERM®, Certified reference material

    Fine dust (PM2.5-like) (extractable ions), ERM®, Certified reference material

    Reference

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