1. 서 론
담자균류의 자실체인 버섯은 다양한 영양소를 포함하고 있는 식품이며 여러가지 활성물질이 존재하여 약용 소재로도 많아 사용된다. 특히 β-glucan과 vitamin D 전구물질 등도 함유하고 있어 기능성 한방의약 소재로서 전세계적으로도 활발하게 연구가 진행되고 있다 (Mattila et al., 1994; Jo et al., 2012). 활엽수의 고목에 무리 지어 발생하는 검은색의 버섯인 목이(Auricularia heimuer)는 젤리처럼 촉감이 부들부들하며 칼로리가 낮고 식이섬유가 풍부한 것으로 알려져 있다(Kim et al., 2012). 중화요리의 탕수육이나 한식의 잡채 요리에서 흔하게 볼 수 있듯 상업적으로 재배가 이루어지고 있다.
버섯은 균류이므로 환경요인에 의해 생육과 모양이 영향을 받는다. 따라서 안전한 수확량을 얻기 위해서는 물론이고 색과 식감 등의 품질이 좋은 목이 생산을 위해서는 목이 재배사의 환경위생 관리가 요구된다. 목이 재배에 영향을 주는 주요 환경 요인으로는 온도, 습도, 환기, 해충, 부유미생물 등이 존재한다. 재배사내 부유미생물은 생물학적 활성을 가지고 있어서 버섯배지의 오염균 또는 버섯병원균으로서 직·간접적으로 버섯의 품질을 하락시키거나 생산량을 감소시킬 수 있다. 일부 부유미생물은 식중독균으로서 버섯을 섭취한 소비자의 건강에 부정적 영향을 줄 수도 있다. 재배사 내의 공기중 미생물 농도가 높으면 재배사에서 작업하는 사람들의 건강에도 유해할 수 있어서 환경부 실내 공기질관리법에서는 실내 다중이용시설에 대하여 실내 공기중 부유세균 농도는 800 cfu/m3 이하로 유지하고 부유진균 농도는 500 CFU/m3 이하로 관리할 것을 권고하고 있다(https://cleanindoor.seoul.go.kr/ contents. do?contentsNo=32&menuNo=193).
버섯 재배사는 온도와 습도가 부유미생물이 증식하기에 적합한 환경을 지니고 있다. 부유미생물은 크기가 작고 가벼워 공기중에 부유하고 기류를 타고 재배사의 이곳 저곳에 퍼져 침강하면서 배지, 생육중인 버섯, 사람의 옷 등에 쉽게 오염을 유발할 수 있다. 특히 버섯의 자실체를 생육하는 방법 중 하나인 톱밥배지에는 유기물 함량이 풍부하기 때문에 오염된 부유미생물이 증식 하기에도 적합한 환경과 에너지원을 제공한다(https:// doi.org/10.23000/TRKO201500010457). 국내에서 재배되는 목이 역시 단기간 생산 및 출하, 공간 효율성 등의 다양한 경제적 장점으로 인해 톱밥배지를 많이 사용하고 있으며, 이러한 톱밥배지에서 재배되는 목이는 재배사내 부유미생물에 노출될 가능성이 존재한다.
목이의 상품성을 저하시키고 식품 안전성을 위협하는 문제점들이 발생하지 않게 하기 위해선 목이 재배사를 지속적으로 모니터링하고 적절한 위생관리를 해야 한다. 이에 따라 본 연구자들은 국내 목이 재배사내 공기중 부유미생물 분리 동정하고 특성을 밝히는 연구를 수행해 오고 있다. 앞선 보고에서는 목이 재배사내 공기중 부유세균에 대한 정보를 제시하였다(Chi et al., 2024). 이어서 본 연구는 국내 목이 재배사내 공기중 부유진균을 분리 동정하고 특성을 밝힘으로써 목이 재배사 실내환경에 대한 미생물상 기초정보를 제공하고 재배사 관리를 효과적으로 수행하는 방법을 개발하는데 기여하고자 수행되었다.
2. 재료 및 방법
2.1 조사 지역 및 기간
본 부유진균 연구는 앞선 부유세균 연구를 수행하면서 동시에 수행되었다(Chi et al., 2024). 전북 익산시 금마면, 전남 완도군 군외면, 전남 완도군 고금면에서 톱밥배지(Sawdust-based media)를 사용하여 목이를 재배하는 곳에서 수행하였다. 연구 조사는 버섯의 자실체 형성 후반 시점인 2022년 6월 후순에 각 재배사의 실내 온도와 습도를 측정하고 실내공기를 포집하여 부유진균을 분석하였다(Table 1).
2.2 재배사내 온습도 측정 및 시료 채집
실내 온도와 습도의 측정은 앞서 연구에서 제시하였다(Chi et al., 2024). 각 재배사내 부유진균을 측정하기 위하여 환경부 실내공기질공정시험 방법에 따라 충돌법에 기반한 측정방법으로서 Anderson sampler (Single Stage Ambient Viable Sampler, Model 10-880, Tisch Environmental, Cleves, OH, USA)를 사용하여 재배사 내 실내공기를 포집하였다(Fig. 1). Anderson sampler는 각 재배사의 입구와 출구를 기준으로 정가운데 지점에서 땅으로부터 1.3 m 높이가 되도록 설치하였고, 28.8 L/min 유량으로 1분 동안 작동하였다(Ahn et al., 2017). 공기 포집은 3반복으로 진행하였다. 부유진균 포집에는 DG18 (Dichloran-Glycerol 18% agar)에 세균 억제를 위해 항생제 Ampicillin과 Streptomycin은 100 μg/mL, Kanamycin은 500 μg/mL 농도로 각각 넣어 준 배지를 사용하였다. 공기 포집 후 배지는 파라필름(Parafilm)으로 밀봉한 뒤 아이스박스에 담아서 저온을 유지하여 실험실로 운반하였다. 진균 배양은 25°C 배 양기에서 3~5일 동안 배양하였다. 균총계수기(Colony Counter)를 이용하여 DG18 배지에 자라난 진균의 균 총수를 계수하였고, 측정유량과 측정시간을 통해 부유 진균의 농도(CFU/m3)를 계산하였다. 배지 위에 형성된 균의 균총 모양, 색, 광택 등 형태학적 특징을 비교하여 서로 다른 균총을 새로운 PDA (Potato Dextrose Agar) 배지에 계대 배양 및 단포자 분리 작업을 통해 순수분리를 진행하였다.
2.3 진균 동정
순수 분리된 진균은 먼저 해부현미경(BX53; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 균총의 크기, 모양, 색 등을 관찰하였고, 미세구조는 광학현미경(BX51DIC Microscope, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하여 형태학적 동정을 진행하였다. 분자적 분석을 위해 순수 분리된 진균은 셀로판을 깐 PDA에서 접종하여 25°C에서 5~7일간 배양 후 균사를 화염멸균한 수술용 메스로 균사체를 수확하여 Beads (Sigma- Aldrich, St Louis, USA)와 CTAB Extraction solution 500 μL (Biosesang, Younin, Korea)와 함께 2 mL Eppendorf tube에 넣고 10분간 Bead beater (TissuLyser LT; Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 균사세포를 파쇄하였다. 파쇄한 균사체는 Direct DNA Prep kit (Navibiotech, Cheonan, Korea)를 이용하여 부유진균의 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 ITS region 특이 Universal primers인 ITS1과 ITS4를 이용하여 PCR (T100 Thermal Cycler; BIO-RAD, Hercules, USA) 을 수행하였다(White et al., 1990). PCR 증폭산물은 1% Agarose gel 전기영동을 이용하여 목적하는 크기의 DNA band의 유무를 통해 증폭에 성공하였는지 확인하였다(Kwon et al., 2015). 확인된 증폭산물은 PCR Purification kit (Navibiotech, Cheonan, Korea)를 사용하여 정제한 뒤, Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였다. 분류군에 따라 필요시 β-tubulin 유전자 및 calmodulin 유전자 마커를 추가로 분석하였다. 분석된 유전자 염기서열은 NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 BLAST program 을 이용하여 종(Species)간 유사도를 확인하였다. 계통분류학적 분석을 위해 비교군 균주의 ITS region 염기서열을 Gen Bank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) database로부터 다운받아서 CLUSTAL W program을 이용하여 다중염기서열정렬(MSA)을 진행하였다 (Thompson et al., 1994). 계통수는 MEGA ver. 6.0 프로그램을 이용하여 작성하였다(Saitou and Nei, 1987;Tamura et al., 2011). 계통수 가지의 신뢰도 평가는 Bootstrap Resampling을 1,000번 반복하여 수행하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 재배사 온도 습도
2020년 6월에 조사한 목이 재배사내 온도와 습도는 Table 1에 제시하였다(Chi et al., 2024). 평균온도는 28.4°C에서 33.9°C 범위에 있어서 재배사 간에 차이가 있지만 재배사 내에서 진균이 생육하는 데는 그다지 제한이 되지 않는 온도 조건임 알 수 있다. 평균 습도는 52.9%에서 78.2%로 분포하였고 이 또한 재배사간 차이가 있었다. 3개 재배사의 지리적 위치가 다르고 재배사 주변 환경이 다른 바 이러한 온도 습도 차이가 존재한 것으로 사료된다. 그러나 6월 하순에 이러한 환경적 차이는 넓은 범위에서 자라는 특성을 가진 재배사내 진균의 생육에는 커다란 영향을 미치지 않을 것으로 보여진다.
3.2 재배사내 부유진균의 농도
재배사내 공기중 부유진균의 농도를 측정하였을 때, 익산 금마면 재배사에서 1.350 × 103 CFU/m3으로 가장 높게 나타났으며 완도군 고금면 재배사에서 3.47 × 102 CFU/m3으로 가장 낮게 나타났다(Table 1). 익산 금마면과 완도군 군외면 재배사는 환경부 실내공기질 권고기준인 500 CFU/m3을 초과하였으며, 특히 익산 금마면 소재 재배사의 경우 약 2.7배 정도 초과하는 것으로 나타났다. 이는 공기 중에 인체 영향이나 목이의 생장 및 자실체 형성에 영향을 끼치는 진균의 존재 가능성이 있음을 시사한다. 또한 완도군 고금면은 권고 기준치를 초과하지 않았으나 거의 기준치에 근접하는 농도를 보였다. 본 연구진이 2022년 5~8월 조사한 느타리, 밀키 버섯, 신령버섯 재배사부유진균 농도는 모두 105 CFU/ m3 수준을 넘는 고농도로 측정되었으며 2023년 6월부터 8월까지 밀키버섯, 산느타리와 여름느타리 재배사는 각각 7.45 × 103 CFU/m3, 9.17 × 103 CFU/m3, 1.12 × 103 CFU/m3로 권고 기준치를 초과하였다(Yoon et al., 2024). 표고버섯 재배사 조사에서도 21곳의 재배사 중 20개의 재배사가 권고기준을 초과하였다(Kim et al., 2018). 이러한 보고에 비추어 볼 때 본 목이 재배사내 실내공기 중 진균오염도의 기준치 초과는 재배사 환경의 특성상 빈번히 나타날 수있는 실태로 사료된다. 따라서 목이 재배사내 공기질 관리가 적절하게 이루어져야 할 것으로 사료된다.
3.3 분리된 부유진균의 동정
재배사내 공기중 순수분리된 진균을 PDA 배지에 접종하여 배양했을 때 콜로니의 형태는 Fig. 2와 같다. 이를 ITS region 유전자 염기서열을 기반으로 분자적 동정을 진행하였을 때, BLAST 프로그램을 통해 Gene Bank에 등록된 유전자 염기서열과 query cover 99%, percent identity 98% 이상의 상동성 유사도를 가지는 진균을 조사하였다. 이들 조사된 진균의 균사와 포자는 광학현미경으로 형태적 관찰과 균총 특성을 조사하여 확인하였다. 그 결과, 진균은 총 12속 15종이 동정되었다(Table 2). 분류학적 관점으로 보았을 때, 강 (Class) 수준에서도 6개로 나뉘어지며 속(Genus) 수준에서 Cladosporium 속이 3종으로 가장 많이 차지하였으나 대부분 겹치지 않고 재배사내 공기중 존재할 수 있는 부유진균의 다양성을 보여주고 있다(Fig. 3). 분 리ㆍ동정된 균주를 종(Species) 수준에서 특성 조사를 하였을 때 15종 중 10종이 인체유해성 또는 식물 병원성 보고가 있는 균주였다(Table 2). 문헌조사 결과 이들 인체유해성 진균으로는 인체에 다양한 질병을 일으킬 수 있는 aflatoxin을 생산하고 일부 침습성 폐아스페르길루스증(Pulmonary aspergillosis)의 원인균으로 보고된 Aspergillus niger (Person et al., 2010), 식중독균 Fusarium oxysporum (Wang et al., 2020), HIV에 감염된 환자에게서 폐성 진균증(Plumonary mycormycosis)의 유발이 보고된 적 있는 Lichtheimia ramose (Kutlu et al., 2014), 인슐린주입펌프치료를 받은 당뇨병환자에게서 봉와직염(cellulitis)의 유발이 보고된 적 있는 Rhizomucor pusillus (Wickline et al., 1989)가 조사되었다. 식물병원성 진균으로는 다양한 기주에서 검은무늬병(Black spot)을 일으키는 Alternaria alternate (Troncoso-Rojas and Tiznado-Hernández, 2014), 감귤류 과일의 괴사를 일으키는 Cladosporium ramotenellum (Murciano et al., 2021), 피칸 잎 반점의 원인균인 Cladosporium subuliforme (Walker et al., 2016), 옥수수에 연한 갈색 병변(Light brown lesions) 을 일으키는 Curvularia lunata (Garcia-Aroca et al., 2018)가 조사되었다. 특히 Penicillium brevicompactum 는 푸른곰팡이병을 일으켜 버섯 재배에 피해를 주는데(Tian et al., 2017) 느티만가닥버섯(Hypsizygus marmoreus)을 오염시킨 균주로 국내에서 보고되었으며(Kim et al., 2020), Periconia byssoides는 항진균제로 작용할 수 있는 β-1,3-glucanase를 분비(Lin et al., 2007)하는 것으로 조사되었다.
4. 결 론
본 연구는 국내에 소재한 버섯 재배사 중 목이 재배사에 정보가 미약한 부유진균에 대한 농도와 종에 대한 정보를 파악하였다. 목이 자실체 형성 후반 시기인 6월 재배사내 온습도 환경은 진균이 생장하기에 무리가 없는 조건에 있었다. 진균의 경우 3개 재배사 중 2개의 재배사에서 환경부 다중이용시설 실내공기질 부유진균 농도 권고기준을 초과하였다. 부유진균은 총 12속 15종이 분리 동정되었고 속 수준에서도 6개 속에 속하는 종이 존재하였다. 전체적으로 Cladosporium 속이 3종으로 가장 많이 차지하였다. 동정된 종 중에서 인체에 영향을 주는 진균인 Aspergillus niger, Lichtheimia ramose, Rhizomucor pusillus 등과 더불어 식물에 병을 일으키는 Alternaria alternata, Cladosporium ramotenellum, Cladosporium subuliforme, Curvularia lunata 등이 존재하였다. 버섯 재배에 영향을 주는 진균으로는 Penicillium brevicompactum이 검출되었다. 본 연구는 목이재배사 부유진균에 대한 국내 최초의 보고이다. 추후 확대된 연구를 통하여 보다 다양한 실내환경 정보를 얻어서 목이 재배사내 환경위생관리를 위한 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
