1.서 론
전세계적인 육류의 소비로 가축사육의 형태가 점차 대량화·밀집화되고 있다(Matusiak et al., 2016, Lee et al, 2012). 축산농가의 사육 증가와 대규모화는 축산 폐 기물의 처리에 문제를 발생시켰고(KOSTAT, 2015) 특 히, 분뇨의 효율적인 처리가 시급한 문제로 대두되었다 (Lee et al., 2012).
그 중 돈사 내부에 방치된 돈분은 불완전한 혐기성 생물학적 분해를 유발하고 그로 인한 악취의 발생은 가축의 건강을 위협하고, 축산농가 주변의 주민들에 의 한 악취 민원을 끈임 없이 증가시키는 원인이 되고 있 다(Clarks et al., 1983; Aarnink et al., 1999; Rappert and Mller, 2005; Park et al., 2005). 특히 돼지 분뇨는 뇨의 함량이 높아서 매우 강한 악취가 발생되는 특징 이 있다(Kim et al., 2002).
또한 이러한 축산 악취는 단순히 사람에게 불쾌감뿐 만 아니라 긴장감, 우울증, 분노, 피로, 혼란 등 감정 장애를 야기할 수 있어 사람에게 육체적, 정신적으로 유해하다(Blanes-Vidal, 2009). 또한, 산업적 측면으로 도 축산 악취는 축산업 확장의 장애요소로도 작용하고 있다(O'Neill and Phillips, 1992).
하지만, 소와 돼지 등에서 발생되는 악취를 처리할 수 있는 뚜렷한 해결책이 없는 것이 현실이다(Yoo et al, 2010).
국내 축산업은 사육농가는 줄어들고 있으나 사육 규 모를 대규모화 하여 축산 악취에 의해 발생하는 환경 문제는 계속 증가하고 있다. 악취의 법정 관리대상 성 분도 2005년의 시행 초기에 8종이었던 것이 최근에는 22종으로 확대되었다. 악취방지법에 명시된 규제 대상 의 악취 성분은 크게 황 계열 악취 성분, 암모니아 (Yamamoto et al 2002) 및 아민의 질소계 악취 성분, 아세트알데하이드와 같은 알데하이드계열, 휘발성 지 방산, 톨루엔과 에틸아세테이트와 같은 유기용제 계열 로 나눌 수 있다.
양돈시설에서 발생되는 악취는 다른 축사에 비해 상 대적으로 높으며(Lee et al., 2017), 이 중 돈분에 관련 된 악취성분으로는 황화수소, 메틸머캅탄과 같은 황화 합물, 부틸산과 같은 휘발성 지방산(Volatile Fatty Acids, VFA), 암모니아, 트리에틸아민, 인돌과 같은 질 소계 화합물이다(Lee, 2011). 또한 악취방지법의 관리 대상은 아니지만, 양돈장에서 발생하는 악취 성분으로 인돌류(크레졸, 인돌, 스크톨)의 악취도 발생하는 것으 로 알려져 있다(Shin et al, 2016).
특히, 축산악취로 인한 피해는 주로 암모니아가스에 서 기인하는데 이는 가축의 체내에서 미생물의 분해에 의한 질소 화합물이 형성된 것으로 소화가 불충분하게 이루어진 사료 및 체내 질소 생성물, 뇨로 배설된 질소 등이 그 구성 물질이 된다(Kim et al., 2007). 암모니아 의 주요 발생원으로는 단백질이나 아미노산과 같은 질 소화합물, 요소, 및 요산의 부패로부터 기인된다.
암모니아 발생 시 총 100수의 양계사육에서 년간 질 소 배출은 81.3~128.9 kg이며, 이중 10% 이상이 암모 니아로 발생된다. 질소원으로부터 15~25%가 분뇨 저 장 중 다시 암모니아로 배출된다고 알려져있다 (Peterson et al., 2007). 축산악취를 해결하기 위한 많은 시도 가 있었고, 그 중 화학적 산화법은 다양한 악취물질을 짧은 시간내에 효과적으로 처리한다는 장점이 있으나 높은 처리 비용과 잠재적인 위험성(유해한 부산물의 생성)이 단점으로 지적되고 있다 (Wang et al., 2013; Hannouda et al., 2016).
반면에, 생물학적 악취제거로서 휘발성화합물과 같 은 주요 악취물질의 농도를 저감할 수 있는 미생물의 연구가 진행되면서 그 관심이 고조되고 있다(Dumont et al., 2014; Jaber et al., 2014). 악취 문제는 악취 성분 자체를 분해하여 제거해야지만 사라지기 때문에 분뇨 의 냄새를 제거하기 위한 악취제거능이 좋은 미생물을 분리하여 선별하는 것이 중요하다(Lee and Lee, 2009).
Acinetobacter sp., Arthrobacter sp. Alcaligenes sp. 등이 Rappert and Muller (2005)에 의해서 이용되어 아 민과 휘발성 지방산을 분해하는데 이용하였고, 황산화 세균인 Thiobacillus sp.를 이용하여 휘발성 황화합물의 분해에 이용한 보고도 있다(Hartikainen et al., 2002; Lee et al., 2005). 즉, 효과적인 축산악취 저감에는 다 른 종류의 미생물이 공존한 환경에서 각각의 미생물의 효능을 기대하거나, 혹은 축산악취를 관능적으로 저감 할 수 있는 우수한 미생물의 개발이 필요하다.
이에 본 연구에서는 축산악취의 대표 물질인 암모니 아와 복합 악취를 저감할 수 있는 미생물을 분리하고 그 미생물의 특성을 파악하여 실제 축산 농가에 적용 가능한 제제용 미생물을 개발하는 것이며, 이와 동시에 미생물을 분자생물학적 기법으로 모니터링 할 수 있는 기술을 개발하기 위한 기초 연구를 수행하였다.
2.연구 방법
2.1.악취 저감 미생물의 분리 및 동정
미생물 접종원으로 분변토와(경기도 A시의 분변토 농장) 활성슬러지(경기도 S하수처리장)를 각각 채취한 후 이를 악취를 발생시킨 배지에 계대배양하여 복합 악취 저감 능력이 우수한 균주를 분리하였다. 악취발생 원으로는 농촌진흥청에서 친환경 유기농자재로 등록되 어 유기질 비료로 이용되는 혼합유박((주)KG케미칼; 피마자박 57%, 채종박 25%, 미강박 18%; C:40.2%, H:5.8%, N:5.3%)을 이용하였다.
유박은 물과 혼합하여 2일 이상 방치 시 분변과 유 사한 악취를 발생시켜준다. 본 연구에서는 100 mL bottle에 증류수 10 mL와 혼합유박 0.25 g를 넣어 악취 를 발생 시킨 후, 위의 분변토 및 활성슬러지를 10% (v/v) 접종한 후에 3일간 30°C, 180 rpm으로 shaking incubator (J-SCRO410-1, JISICO, Korea)에서 배양하 였다. 그 중, 가장 악취 발생이 적은 바이알을 선택하 여 연속 희석하여 LB plate에 도말하고 30°C incubator 에서 배양하였다. 배양된 콜로니(colony)를 대상으로 악취저감능을 관능법을 이용해 평가하여 악취 저감 미 생물을 분리하였다.
분리 균주의 콜로니를 0.5N NaOH 30 μL에 현탁시 킨 후 95°C에서 30분간 가열하여 균체를 lysis 시켰고, 그후 추출된 genomic DNA를 template로 하여 polymerase chain reaction (TP600, TAKARA Bio, Japan) 을 수행하였다. DNA template 1 μL, primer (10 pmol) 각각 1 μL, 2x Taq mix는 12.5 μL를 넣고 dH2O 9.5 μL 첨가하여 총 부피를 25 μL로 하였다. 이때 사용 한 primer는 universal primer로 27f (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AC-3’)와 1492r (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT-3’)이다.
PCR 조건은 93°C에서 2분 동안 pre-denaturation한 후, 92°C에서 denaturation 1분, 55°C에서 annealing 1 분, 68°C에서 extension 45초 과정을 35 cycle 반복한 후, 72°C에서 2분 동안 최종 extension한 후 4°C에서 holding으로 하였다. PCR로 증폭된 DNA의 염기서열 을 분석하였다. 분석된 염기서열은 ClustalX로 다중정 렬을 수행하였고, BioEdit 프로그램을 이용해 염기서열 을 정리하였다(Hong and Lee, 2016). 정리된 염기서열 은 MEGA4프로그램으로 Neighbor-Joining (NJ)방법으 로 계통학적 분석이 수행되었다(Hong and Lee, 2014).
2.2.분리미생물의 악취 저감능 평가
100 mL bottle에 증류수 10 mL와 유박 0.25 g를 넣 어 실리스토퍼(sili stopper)로 막은 후 공기가 유입되지 않게 실링테잎(sealing tape)으로 밀봉하였다. 밀봉된 bottle은 30°C shaking incubator (J-SCRO410-1, JISICO, Korea) 에 넣어 만 3일 배양하여 유박으로 부터 악취 를 발생시켰다.
악취를 발생 시킨 후에는 1 mL syringe (Korea vaccine co., Korea)를 이용해 미리 배양해 둔 악취 저감 미생물을 10%를 접종하였다. 악취 저감 미생물은 LB broth를 배지로 사용하였고, 30°C, 180 rpm으로 incubator에서 배양하였다.
배양하는 동안 24시간 간격으로 저감 되는 암모니아 의 농도를 검지관 및 검지펌프(GV-100, Gastec, Japan) 을 이용하여 발생된 악취 가스 중에 100 mL 를 채취하 여 측정하였고, 측정 농도의 범위는 0.32-32 ppm (SH, Gastec, Japan)과 2.5-200 ppm (3La, Gastec, Japan)의 검지관을 사용하였다. 이용 시 지압계(indicator)의 흐 름이 완료(flow finish)를 나타낼 때 분석을 종료하였다.
또한, 복합 악취는 관능법을 이용하여 측정하였는데 발생하는 악취의 양이 소량이기 때문에 공정시험법으 로 악취 발생의 유무를 측정할 수 없어 간이로 5명의 패널을 선정하여 배양 3일 후 악취의 발생 유무만 판 단하였다.
복합 악취를 악취 강도로 판정하는 것은 악취공정시 험법의 악취판정표에 의거하여 후각이 정상이고 건강 한 사람 5인을 대상으로 무취 0도에서 참기 어려운 취 기 5도로 정한 후 판정하였다. 악취 강도 인식을 위해 노르말부탄올(순도 99.5% 이상)을 희석하여 제조 시킨 인식시험액을 대상으로 악취 강도 인식을 통과한 대상 자를 선정 한 후 실험에 참가 시켰다(ME, 2007).
2.3.분리미생물의 생리활성 측정
분리된 악취 저감 미생물의 생리활성은 각기 다른 배양 온도 조건과 각기 다른 pH 배지에서 미생물을 배 양해 성장 특성을 평가하였다. 온도 조건은 10°C, 20°C, 30°C, 그리고 40°C에서 180 rpm으로 shaking incubator (J-SCRO410-1, JISICO, Korea)에서 배양하 였고 배지는 LB broth를 사용하였으며 24시간 간격으 로 600 nm에서 OD값을 측정하였다.
pH별 실험은 pH 4, pH 6, pH 7, pH 8, 그리고 pH 10으로 총 6가지 조건에서 실험을 수행하였다. 각각의 배지는 다음과 같은 조성으로 구성하였다(pH2, 0.2M KCl 25 mL과 0.2M HCl 5.3 mL; pH 4는 0.1M C6H8O7 33 mL과 0.1M C6H5O7Na3 17 mL; pH 6은 0.2M NaH2PO4·2H2O 32.5 mL과 0.2M Na2HPO4· 12H2O 4.1 mL; pH7은 0.2M NaH2PO4·2H2O 13.00 mL과 0.2M Na2HPO4·12H2O 20.34 mL; pH8은 0.2M NaH2PO4·2H2O 1.76 mL과 0.2M Na2HPO4· 12H2O 31.56mL; pH10은 0.2M Glycine 25mL과 0.2M NaOH 16.00 mL을 혼합한 후 각각의 배지의 총 부피 가 100 mL이 되도록 D.W를 첨가해 주었다.
그 후 각각의 pH buffer과 LB broth를 1:1(v/v)으로 혼합하였다). 미생물은 30°C에서 180 rpm으로 shaking incubator에서 배양하였고 24시간 간격으로 600 nm에 서 OD값을 측정하였다.
2.4.분리미생물의 모니터링 기법 개발
본 연구를 통해 분리된 Staphylococcus cohnii HYC- 3과 Staphylococcus carnosus JYC-4을 돈사에 적용 시 돈사내에서의 생존량을 모니터링 할 수 있는 기법을 확립하기 위해 두 미생물 만을 검출 할 수 있는 Taq- Man probe와 primers를 제작하였다.
HYC-3의 forward와 reverse primers는 각각 5'- GCG CAG AGA TAT GGA GGA ACA -3'과 5'- CCC ACG CTT TCG CAC ATC AG -3'이고 probe는 5'- CCA GTG GCG AAG GCG ACT TTC T -3'에 5' end에는 FAM (6-carboxyfluorescein)을 라벨링하였다.
또한, JYC-4는 forward와 reverse primers가 각각 5'- GTG GCG AAG GCG ACT TTC -3' and 5'- GCG TGG ACT ACC AGG GTA TC -3'였고, probe는 5'- TGG TCT GCA ACT GAC GCT GAT GT -3'로 제작 하였으며 5' end에 FAM (6-carboxyfluorescein)으로 라 벨링 하였다.
제작된 primer와 probe를 이용해 HYC-3과 JYC-4만 특이적으로 검출하는지 확인하였고, HYC-3과 JYC-4 의 DNA 농도와 cfu의 상관관계를 나타내는 검량선과 CT값과 cfu로 환산할 수 있는 검량선을 작성하였다. Real time PCR (08061070, ILLUMINA, San Diago, USA)조건은 95°C에서 10분간 initial denaturation, 그 후 95°C에서 10초간 denaturation과 60°C에서 30초간 annealing 과정을 40 cycles 수행하였다. 모든 실험은 3 반복으로 수행하였다.
3.결과 및 고찰
3.1.악취저감 미생물의 분리 및 동정
돈분복합악취 저감 능력이 우수한 균주를 분변토 및 활성슬러지를 접종원으로하여 분리하였다. 돈분악취는 주요 악취물질이 국내 악취방지법상의 지정악취물질 22종에 포함되지 않는 페놀류가 악취의 주요 인자이다.
따라서, 암모니아 및 황화수소를 지표로 할 경우 각 물질에 대한 저감 능력은 우수하나 현장에서 큰 효과 를 보기 어렵다. 따라서, 현장에서 악취저감 효과를 기 대하기 위해서는 복합악취저감효과가 높은 탈취제가 개발되어야한다.
균주를 탐색하는 과정에서 관능적으로 평가하였으며, 악취가 발생하지 않는 바이알을 선택하여 우수 균주로 간주하였다. 선택된 균주는 배양액을 배지에 도말 한 후, 색과 모양이 다른 colony를 10개 선별하였다. 선별 된 colony는 다시 유박을 이용한 악취저감테스트를 수 행하였다.
실험구의 악취를 관능법으로 측정한 결과 두 종류의 colony를 접종한 바이알에서 가장 적은 악취가 발생하 였다. 이들을 순수 분리한 후 동정한 결과(Table 1), 각 각 Staphylococcus cohnii와 Staphylococcus carnosus로 밝혀졌다.
각각의 균주는 생 분뇨로 만든 비료에서 분리한 Staphylococcus cohnii strain RCB144과 전통적인 방법으 로 발효시킨 육류로 부터 분리한 질산염 환원 미생물 인 Staphylococcus carnosus strain 1709와 유사도가 98 과 99%로 나타났다(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). 분 리된 악취 저감 미생물은 HYC-3과 JYC-4로 명명하였 고 이들의 악취저감능력을 평가하였다.
3.2.분리미생물의 악취저감능 평가
분리균의 악취저감 실험은 위의 악취바이얼 실험과 동일하게 수행되었고 이를 대조군(미생물 무접종)과 비교하였다. 분리된 미생물 중 HYA-1균주(Fig. 1 &2 (a))와 JYA-1 (Fig. 1 & 2(c)) 균주 그리고 Staphylococcus cohnii HYC-3 (Fig. 1 & 2 (b))과 S. carnosus JYC- 4 (Fig 1 &2 (d))의 활성을 비교하였다.
먼저, 복합악취제거능을 살펴본 결과(Fig. 2), 미생물 을 접종하지 않은 바이얼(대조군)의 경우 악취가 최대 로 발생하여 실험을 진행시킨 3일간 취기 5도를 유지 하였다. 균주를 접종한 바이얼에서는 각각 접종된 균주 에 따라 정도는 차이가 있었으나 악취가 저감되었다.
그 중 HYC-3(Fig. 1 (b))와 JYC-4 (Fig 1 (d))는 반 응 3일이 경과한 후에 각각 취기 2.5 및 2.2로 저감됨 을 확인하였다.
축산악취의 대표물질의 하나인 암모니아(NH3)의 저 감을 비교하여 보았다(Fig. 2). 복합악취와 마찬가지로 미생물이 접종되지 않은 대조군에서는 악취의 발생에 큰 변화가 없고 균주의 접종한 실험군에서는 암모니아 가 저감되었다. 분리균주 HYC-3 (Fig. 2 (b))와 JYC-4 (Fig 2 d))는 반응 3일이 경과한 후에 각각 초기 농도 25 ppm에서 각각 5 ppm 및 3 ppm으로 저감됨을 확인 하였다.
3.3.분리미생물의 생리활성 측정
분리된 악취저감 균주 HYC-3과 JYC-4의 생리활성 을 각기 다른 온도와 pH배지를 이용하여 평가하였다 (Fig. 3). 그 결과 HYC-3의 경우, 배양 4일째를 기준으 로 배양 온도가 30°C일 때 균주의 생장이 OD값을 측 정하였을 때 제일 좋았으며, 그 다음으로 40°C, 20°C 순이었고, 10°C일때는 성장하지 못했다(data not shown). JYC-4도 HYC-3과 마찬가지로 30°C > 40°C > 20°C >10°C순으로 성장 하였다(data not shown)).
균주의 생장속도(g·h−1)를 생체량(건조중량, g)으로 나눈 비생장속도(h−1)로 계산한 후 최적 온도인 30°C에 서의 값을 최대치 1로 가정한 후 상대적 비생장속도 (relative specific growth rate)를 알아보았다. 20°C에서 는 균체량이 적어 상대적 비생장속도는 30°C > 20°C > 40°C > 10°C로 나타났다(Fig. 3 (a)).
각기 다른 pH에서의 성장은 두 균주가 다소 다른 경 향을 보였다. HYC-3은 배양 4일째를 기준으로 OD값 을 측정한 결과, pH7일 때 제일 우수 했지만 pH8과 10도 큰 차이를 보이지 않았다(data not shown)). JYC- 4는 pH10일 때 성장이 제일 우수 했지만 pH8, 7, 6으 로 pH가 낮아질수록 큰 저해를 받지 않았다. 그러나 두 균주 모두 pH 4일때는 거의 성장하지 못했다(data not shown). HYC-3균주 및 JYC-4균주의 최적 pH는 7 과 10이였다(Fig. 3 (b)). 각기 다른 pH 조건에서도 위 의 온도 조건에서와 동일한 방법으로 비생장속도를 계 산한 후 상대적 비생장속도로 비교하였다.
HYC-3 균주의 상대적 비생장속도는 pH 7 > pH 8 > pH 10 > pH 6 > pH 4이었으며, JYC-4 균주는 pH 10 > pH 7 > pH 8 > pH 6 > pH 4의 상대적 비생장속도를 보였다.
3.4.분리미생물의 모니터링 기법 개발
복합악취 저감 능력이 우수한 미생물인 HYC-3과 JYC-4 균주를 현장에 적용 시 악취저감효과를 검증하 기 위한 분자모니터링방법을 알아보았다. 분리 균주의 전체 DNA 염기서열 중에서 probe 제작에 이용한 부 분을 Table 2에 표시하였다. 제작된 probe와 primer의 민감도를 측정하기 위해 다른 종류의 악취 저감 미생 물을 대상으로 real time PCR을 수행한 결과를 Table 3에 제시하였다.
Real time PCR결과값인 Ct 값은 낮을수록 제작된 probe에 대한 민감한 반응을 보이는 것이다. 농업용 미 생물제제로 많이 사용되며, 본 연구진이 보유한 Lacobacillus, Arthrobacter, Bacillus 등의 경우 검출이 안되 거나 민감도가 낮았다. 분리 균주인 Staphylococcus cohnii HYC-3. S. carnosus JYC-4 두 균주의 경우 제 작된 probe에 대한 민감한 반응을 확인하였다. 즉 제작 된 probe를 이용하여 현장 시료내에 HYC-3과 JYC-4 균주의 정량분석 및 실시간 모니터링이 가능하며 악취 데이터와 비교를 통한 미생물의 효과를 확인할 수 있다.
4.결 론
축산 악취는 암모니아 혹은 황화수소와 같은 단일 악취저감효과만으로 현장에서 만족할만한 저감효과를 기대하기 어렵다. 따라서, 복합악취를 효과적으로 저감 할 수 있는 미생물의 개발이 매우 중요하다. 또한, 생 물학적 악취저감 효과를 기대하기 위해서는 미생물의 정량화를 통해 이를 검증하는 것이 중요하다.
개발된 분자생물학적 방법은 미생물제제를 투여한 축산현장에서 분뇨 등의 시료에 존재하는 특정한 미생 물의 민감한 정량분석이 가능하다. 따라서, 본 연구에 서 개발한 Staphylococcus cohnii HYC-3및 S. carnosus JYC-4은 축산 현장에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
