1.서 론

2010년 이래로 고병원성 조류인플루엔자(highly pathogenic avian influenza, HPAI), 구제역 등과 같은 가축 질병의 발생빈도가 급격히 증가하고 있다. 특히 AI의 경우 철새로부터 전염되는 것으로 알려져 있으나 AI의 발생 빈도와 규모가 급증하고 있어 토착화가 우 려되고 있다.

가축 질병이 발생할 경우 감염가축을 대규모로 살처 분하고 있어 경제적 손실과 더불어 많은 환경문제가 유발되고 있다(Sobrino et al., 2001; McLaws et al., 2006; Ko and Seol, 2013). 2010~2011년 구제역이 대 규모로 발병하여 약 350여만 마리의 가축이 살처분되 었고(Kim and Lee, 2012), 2016년 11월에서 2017년 1 월 사이에는 AI로 약 3,200만 마리의 가금류가 살처분 되었다.

감염가축의 처리는 매몰법, 소각법, 퇴비화법, 산/알 칼리 처리법 등 다양한 방법들이 사용되고 있다 (Gwyther et al., 2011). 가금류의 경우 크기가 작아 사 체 분해가 빠르고 매몰처리장 규모가 작아 2차 환경오 염 문제 발생이 적다. 반면에 돼지와 같은 대형 가축의 경우 처리가 어려울 뿐 아니라 다양한 2차 환경오염을 유발하는 등 많은 문제점들이 발생되고 있다.

사축(죽은 가축)의 분해과정은 토질, 온도, 습도 등의 분해환경과 분해에 관여하는 세균군집의 거동 특성과 밀접한 관련이 있다. 사축이 분해되는 동안 발생되는 분해가스의 성상에 대한 연구가 여러 연구진에 의해 진행되었고(Dekeirsschieter et al., 2009; Brasseur et al., 2012; Chae et al., 2016), 세균군집 변화에 대한 연 구도 부분적으로 진행되어 왔다(Schloss et al., 2003; Ryckeboer et al., 2003; Yamamoto et al., 2009; Howard et al., 2010; Hyde et al., 2013; Martins et al., 2013; Tkachuk et al., 2014). 사축의 분해과정에서 발생되는 분해가스는 성상이 다양할 뿐 아니라 매몰층의 깊이와 경과 시간에 따라 지속적으로 변화하기 때문에 함축적 인 정보를 얻기가 어렵다. 감염 가축의 처리방법 선택 과 매몰지의 관리를 위해서는 매몰처리 된 사축의 분 해과정에 관여하는 세균군집의 거동 특성과 더불어 악 취발생 성상과 환경인자들과의 상호작용 또는 상호관 계에 대한 이해가 필요하다.

본 연구의 선행연구에서는 사축의 처리과정에서 야 기되는 환경문제를 최소화하기 위한 방안으로 혐기적 고온 매몰퇴비화법을 제안하였고, 돼지 사체의 분해과 정에서 발생되는 악취특성을 연구하였다(Yang et al., 2017). 본 연구에서는 Yang et al. (2017)의 혐기적 고 온 매몰퇴비화법에서 세균군집의 거동 특성을 조사하 고, 사체 분해과정에서 발생되는 악취물질, 세균군집, 환경인자들간의 상관관계를 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA), 정준상관분석(Canonical Correlation Analysis, CCA), extended Local Similarity Analysis (eLSA)를 이용한 네트워크 분석을 통해 고찰하였다.

2.연구내용 및 방법

2.1.실험 재료 및 장치

본 연구는 전남 순천시 000 지역에 사축 매몰처리 시험장을 구축하고, 2 m (W) × 2.8 m (L) × 2.5 m (H) 크기의 시험용 매몰셀들을 조성하였다(Fig. 1). 시험용 매몰셀에 대한 규격과 실험방법은 Yang et al. (2017) 에 자세히 설명하였다. 사용된 매몰용 사축은 순천시 인근의 OOO 도축장으로부터 구입한 중량 80~90 kg의 요오크셔 품종의 성돈 6마리를 사용하였다. 조성된 시 험용 매몰셀 내부에 돼지 사체를 매몰하고, 가스 포집 관 3개(표층으로부터 0.6 m (B1, 상단), 1.2 m (B2, 중 단), 및 1.8 m (B3, 하단) 깊이), 고체매질시료 채취관 10개, 및 열전쌍 등을 설치하였다.

고체매질 시료 채취관은 4개의 시료 채취구(S1~S4) 로 구성되어 있으며, 채취구는 지표면으로부터 각각 0.6 m (S1), 1.0 m (S2), 1.4 m (S3), 1.8 m (S4) 깊이에 위치하도록 설치하였다. 시험용 매몰셀은 혐기성 조건 하에서 329일 동안 운전되었다. 사축이 분해되는 동안 시험용 매몰셀에 설치된 고체매질시료 채취관을 0, 76, 138, 및 329 일에 수거하여 퇴비시료를 수집하였다. 본 연구에서는 S1, S2, S4 지점에서 채취한 시료를 각각 상단(S1), 중단(S2), 하단(S4)으로 구분하여 세균군집분 석에 사용하였다.

2.2.세균군집 분석

고체 매질 시료 채취관으로부터 채취한 퇴비시료로 부터 다음과 같은 분석과정을 거쳐 세균군집을 분석하 였다. DNA를 NucleoSpin 토양 키트(Macherey-Nagel GmbH, Dren, Germany)를 사용하여 각각 추출하고, BeadBeater-8 시스템(BioSpec, Bartlesville, USA)을 사 용하여 5,000 rpm으로 30 초 동안 시료를 파괴시켰다. DNA를 용리 완충액 100 μL에서 용리시키고 사용하기 전에 -20°C에서 보관하였다. DNA는 ASP-2680 분광 광도계(ACTGene, Piscataway, USA)를 사용하여 정량 화 하였다.

추출된 DNA는 파이로시퀀싱(pyrosequencing)법을 사용하였다. PCR (polymerase chain reaction)을 위해 50 μL PCR mixture를 기준으로 증류수 33.92 μL, 10x buffer with MgCl₂ (ACE) 5 μL, 2.5mM dNTPs 4 μL, BSA 0.8 μL, 5u/μL Taq polymerase (ACE) 0.25 μL, 10 μM 805r (Fusion) 2 μL, 10 μM 340f (Multiple Identifiers, MID) 2 μL, DNA 2 μL를 사용하였다. 샘플 의 농도에 따라 DNA 주입량을 조정하였으며, 조정된 양은 증류수로 보정하였다. 사용된 10 μM 340f (MID) 는 각 샘플마다 다른 MID 정보를 가지고 있는 것으로 사용하였다. PCR mixture는 Negative를 포함하여 총 5 배 분량으로 제조하였다. PCR은 다음과 같은 조건으 로 수행되었다. 94°C에서 3 분간 pre-denaturation 시킨 후, 94°C에서 45초간 denaturation, 50°C에서 45초간 annealing, 72°C에서 45초간 extension시키는 과정을 35회 반복하였다. 그 후 final extension을 위해 72°C에 서 5 분간 유지한 후 4°C에서 보관하였다. PCR기기는 GeneAmp® PCR system Model 2700 (Applied Biosystems) 을 이용하였다. 완료된 PCR product는 1.5% agarose gel에서 100 V로 30분간 전기영동으로 확인하였다.

확인된 PCR 샘플은 2% agarose (low melting gel) 에 모두 loading 하고 전기영동으로 확인하였다. PCR 산물의 크기는 약 500 bp로, 그에 상응하는 밴드 부분 의 한천 젤을 잘라내어 QIAquick Gel extraction kit (Qiagen)를 이용하여 정제/회수하였고, 그 방법은 설명 서에 따라 수행하였다. 정제된 DNA의 농도는 ASP- 2680 spectrophotometer (ACTGene, Piscataway, USA) 을 이용하여 측정하였다. 측정된 농도를 일정범위로 맞 추기 위해 elution buffer를 이용하여 고농도의 샘플을 희석하였다. 또한 전기영동 및 Real time PCR (QPCR) 을 통해 농도를 확인 하였다. 전기영동 농도측정은 1.5% agarose gel을 이용하여 확인된 band 부분을 Carestream MI를 사용하여 강도(intensity)와 면적의 곱한 값을 기준값으로 나누어 수치화하였다.

Real time PCR은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. Real time PCR Mixture 25 μL는 2 μL DNA, 2.5 μL PCR buffer (10X), 2.5 μL, dNTPs 2 μL, BSA 0.4 μL, 10 μM Primer 340f 0.5 μL, 10 μM Primer 805r 1 μL, SYBR (50X) 0.5 μL, ROX（50X) 0.5 μL, Taq polymerase (ACE) 0.125 μL, 증류수 15.475 μL을 사용하였다. Real time PCR은 다음과 같은 조건으로 수행되었다. 95°C에서 3분간 Initial-denaturation 시킨 후, 95°C에서 15초간 denaturation, 50°C에서 30초간 annealing, 72°C 에서 30초간 extension시키는 과정을 35회 반복하였다. 그 후 final extension을 위해 82°C에서 30초 유지하였 다. 세 종류의 방법으로 확인된 농도는 각 방법에서 기 준값을 설정하여 그 값이 1~3 사이의 범위에 오도록 환산하고, 최종 정량 값인 40 μL를 기준으로 환산하여 혼합 용량을 확인하였다. 혼합 용량이 확정된 샘플은 멸균된 2 mL micro tube에 혼합하여 냉동하여 Macrogen Incorporation (Seoul, Korea)에 분석을 의뢰하였다. 분석된 결과를 토대로 각 매몰방법에 따른 단계별 우 점종의 변화 및 군집구성의 변화를 확인하였다.

2.3.주성분 분석과 네트워크 분석

사축의 분해과정에서 시간 경과에 따른 매몰층의 높 이와 세균군집 구조 및 발생 악취성상과의 상관관계, 세균군집 구조-발생 악취성상-환경인자들(pH, ORP, T 등)간의 상관관계는 SPSS 21을 사용하여 주성분 분석 (PCA)을 수행하였다. 또한, 악취가스 발생에 대한 주요 세균종들의 상관관계는 CCA로 분석하였다. 사체 분해 과정에서 발생되는 악취 가스 성상에 대한 자료는 Yang et al. (2017)에 의해 보고된 data를 사용하였다. 사축의 혐기적 퇴비화과정에서 발생되는 악취와 환경 인자들 간의 네트워크 분석은 소프트웨어 Extended Local Similarity Analysis (eLSA) (Xia et al., 2011)의 기본 설정을 사용하여 계산된 입력 상관관계를 사용하 여 Cytoscape 소프트웨어(Shannon et al. 2003)를 사용 하여 수행하였다. 미생물 연관성을 국소 유사성 점수로 시각화하고 Cytoscape 프로그램 버전 3.3.0 (Shannon et al. 2003)을 사용하여 p 값을 결정했다

3.결과 및 고찰

돼지 사체가 고온혐기성조건에서 분해되는 동안 매 몰층 높이별로 세균군집 변화를 파이로시퀀싱법으로 분석하였다. 군집을 구성하고 있는 세균을 문(phylum level))과 과(family level) 수준에서 분석한 문과 과의 구성 비율을 각각 Fig. 2와 Fig. 3에 도시하였다.

사축의 매몰재료로 사용한 돈분퇴비의 세균군집 구 성은 Firmicutes (66%), Proteobacteria (13%), Deinococcus-Thermus (10%) 이었다. 과 수준에서 세균군집의 구성은 간균과(Bacillaceae) 44%, Thermaceae 10% 이 었고, Pseudomonadaceae, Incertae_Sedis_XI, 및 Thermoactinomycetaceae 가 각각 5%, unclassified 19%, Aeromonadaceae 4%이었다. 시험용 매몰셀에 돈분 퇴 비만을 채운 대조군에서 돈분퇴비는 시간이 경과됨에 따라 Firmicutes 의 비율이 점점 더 증가하여 약 230일 경과 이후에는 그 비율이 98%로 절대적 우점균으로 변화하였다(data not shown).

사축 매몰층 상단(S1)에서 사축의 분해초기(매몰 후 76일 경과시점)의 우점세균은 Firmicutes (86%), Actinobacteria (4%), Proteobacteria (4%)이었고, 분해 말기 (329일 경과 후)에는 Firmicutes (94%)의 우점 비율이 더 높아졌다. 과 수준(family level)의 세균군집은 분해 초기(76일 경과)에는 간균과(Bacillaceae, 44%), 써머 액티노마이세타지과(Thermoactinomycetaceae, 12%), 클로스티리디움과(Clostridiaceae, 9%), 방선균과(Actinomycetaceas, 4%)의 비율이 약 69% 이었고, 분해말 기단계(329일 경과)에는 Clostridiaceae (73%), Bacillaceae (13%), 및 Actinomycetales (4%)의 비율이 약 90%로 Clostridiaceae의 우점비율이 증가하였고 Bacillaceae의 우점비율이 낮아졌다.

매몰 돼지사체층 바로 윗부분인 매몰층 중단(S2)에 서 우점 세균군집은 초기(76일)에는 Firmicutes (80%) 이었고, 분해가 진행됨에 따라 말기단계(329일)에는 Firmicutes의 우점비율이 69%로 낮아진 반면 Deinococcus- Thermus의 우점비율이 18%로 높아졌다. 과 수 준에서 우점 세균군집의 비율은 초기에는 Bacillaceae 40%, Thermaceae 9%, Lactobacillaceae 8%, Thermoactinomycetaceae 8%, Paenibacillaceae 4% 이었고, 분해 말기단계에서는 Bacillaceae 44%, Thermaceae 18%, Thermoactinomycetaceae 8%, Actinomycetales 7%, Clostridiaceae 5% 이었다.

사축이 매몰된 지점인 하단(S4)에서 우점 세균군집 비율은 초기에는 Firmicutes 77%와 Proteobacteria 18%이었으며, 분해 말기 단계에서는 Firmicutes로 우 점화 되었다. 과 수준에서 우점군집 비율은 초기에는 Clostridiaceae 23%, Sphingomonadaceae 5%, Bacillaceae 2% 순이었고, 분해말기에는 Bacillaceae 46%, Thermoactinomycetaceae 15%, Lactobacillaceae 4% 순이었다.

Howard et al. (2010)의 연구에 의하면 돼지 사체가 17~31°C의 지표면에서 분해될 때 우점종은 Acinetobacter 이었고, 생체조직의 지방인 시랍(adipocere)에서 분리한 세균은 Pseudomonas, Serratia, Bacillus 등의 지방분해 세균들이었다(Pfeiffer et al., 1998; Horswell et al., 2002). 또한, 사축이나 가축분뇨의 퇴비화 과정 에서 50°C 이하에서는 Pseudomonas, 대장균, 살모로 넬라와 같은 프로테오박테리아(Protepbacteria)가 주로 관찰되었다(Ryckeboer et al., 2003; Schloss et al., 2005; Tkachuk et al., 2014). Protepbacteria는 50°C 이 상으로 온도가 증가함에 따라 현저하게 감소하였고 (Ryckeboer et al., 2003; Schloss et al., 2003; Tkachuk et al., 2014), Firmicutes가 증가하였다(Ryckeboer et al., 2003; Schloss et al., 2003; Yamamoto et al., 2009; Martins et al., 2013; Tkachuk et al., 2014). 본 연구에서도 고온에서 발효되어 숙성된 돈분퇴비의 세 균군집 비율은 고온이나 극한 환경에서 주로 서식하는 Firmicutes와 Deinococcus-Thermus 가 79%로 높았다. 돼지 사체가 분해되는 동안 혐기적 퇴비화과정에서 온 도가 40~60°C까지 상승하였고 Firmicutes와 Deinococcus- Thermus가 87~100%를 차지하는 등 선행 연구결 과들과 잘 일치하며, 사체의 분해 환경에 따라서 관여 하는 세균군집이 달라지는 것을 알 수 있다.

55°C 이상에서 사축이 분해되는 과정에서 과 수준 (family level)의 세균군집은 Bacillaes, Actinomycetales, Thermobifida, 및 Clostridia 등이 현저하게 증가하였다 (Tkachuk et al., 2014). 본 연구에서도 사체의 분해가 40~60°C의 온도범위에서 진행되므로 고온에서 생장이 가능한 Bacillaceae, Clostridiaceae, Thermoactinomycetaceae, 및 Thermaceae의 우점비율이 높게 나타났다. Thermaceae 는 Deinococcus-Thermus목에 속하며 호열 성 또는 약 호열성이다. Thermoactinomycetaceae는 55~65°C에서 가장 잘 자라는 호기성의 호열성 mycelium- forming actinomyce로 주로 퇴비와 습기찬 건초 더미 등에서 주로 관찰된다. Thermoactinomycetaceae 와 Clostridia 중에는 혐기적 조건에서 100°C 이상에서 도 생존할 수 내생포자를 가진 균들이다(Mitschrlich and Marth, 1984). 특히 본 연구에서는 숙성된 돈분퇴 비를 사용하였고 사축의 분해가 40~60°C의 고온에서 진행되어 타 연구들 보다 세균군집이 고온균으로 단순 화된 특징이 있다.

돼지 사체가 분해되는 동안 매몰층의 높이별 세균군 집변화에 대한 PCA 결과를 Fig. 4에 제시하였다. 세균 군집은 매몰층의 높이에 따라 상이하며, 사체의 분해 진행에 따라 변화하였다. PCA 분석을 통해 세균군집 구조가 매몰층의 높이에 따라 현저하게 다르고, 돼지 사체가 분해됨에 따라 매몰층 하부보다는 표층으로 갈 수록 시간에 따른 세균군집의 변화가 큼을 확인할 수 있었다.

사축이 분해되는 동안 매몰층의 높이별로 시간경과 에 따라 발생된 악취성분들에 대한 PCA 결과를 Fig. 5 에 도시하였다. 혐기적 고온 매몰퇴비화법에서 복합악 취의 평균 희석배수와 주요 악취 기여물질인 황화계 악취 물질 4종(황화수소(H₂S), 메틸메르캅탄(CH3SH, Methanethiol, MeSH), 황화메틸(Dimethyl Sulfide, DMS), 이황화메틸(Dimethyl Disulfide, DMDS)), 프로피온알 데하이드, 뷰틸아세테이트 등의 농도는 사축이 매몰된 하단에서 표층으로 갈수록 점점 낮았다(Yang et al., 2017). 이들 결과들을 주성분분석을 하였을 때 퇴비층 의 높이에 따라 악취 거동 특성이 상이하였다. 사체가 분해되는 동안 발생되는 악취의 거동특성은 돼지 사체 매몰층 바로 위인 중단에서 가장 많은 변화가 심하였으 며, 사축이 매몰된 하단에서 변화가 가장 적었다. 분해 말기에는 중단과 하단의 악취거동 특성이 유사하였다.

사축이 매몰되어 있는 하단에서 미생물과 발생 악취 물질들에 대한 CCA분석 결과를 Fig. 6에 도시하였다. 단백질 분해과정에서 많이 발생되는 황화계 악취물질 들 중 혐기공정에서 악취기여도가 가장 높은 MeSH의 생성과 연관성이 높은 세균은 Clostridiaceae 이었고, DMDS 생성에 관여하는 세균은 Bacillacea와 Clostridium, 황화수소 생성과 상관관계를 보이는 종은 Clostridiales, Oceanobacillus, 및 Thermoanaerobacteraceae 이었다.

사축의 분해말기에 주로 발생되는 알데히드류의 생 성과 상관관계를 보인 주요 미생물은 Clostridiaceae_1, Paenibacillaceae, Sphingomonadaceae, 및 Lactobacillaceae이었다. VOCs와 상관관계가 있는 미생물군은 methyl ethyl ketone (M.E.K)와 butyl acetate(B.A)는 Planifilum, 톨루엔 생성과 연계된 세균은 Nocardiopsaceae, Planococcaceae, Clostridia, Incertae_Sedis_ 등 이고, 자일렌은 Sporacetigenium과 Bacillales 이었다.

사축의 혐기적 퇴비화과정에서 발생되는 악취와 환 경인자들간의 상관관계에 대한 네트워크 분석 결과를 Fig. 7에 도시하였다. 사축 분해과정에서 ORP는 toluene, o-xylene, 및 트리메틸아민(TMA)의 발생량과 양 의 상관관계가 있고, butyraldehyde(B_A), butyric acid (B.A.), 및 메틸이소부틸케톤(MIK)과는 음의 상관관계 에 있다. pH는 다양한 알데히드류와 VOCs 물질들과 의 양의 상관관계 있는 것으로 분석되었다. 즉 pH가 증가함에 따라 이들 물질들의 생성이 증가하는 경향을 보였다. H₂S, DMS, DMDS, MeSH 등의 황화계 물질 들간에는 양의 상관관계를 보이며, 질소성 악취물질 (NH₃, TMA), 알데히드류, 유기산, 및 톨루엔 등의 VOCs 들은 음의 상관관계를 보였다. 다만, 메탄생성과 는 DMDS만이 양의 상관관계에 있다. 즉, 황화계 물질 들이 주로 발생될 때에는 다른 물질들의 생성이 감소 함을 의미한다. 사체 분해과정에서 발생되는 메탄가스 와 이산화탄소의 경우 황화계 악취물질이 활발하게 배 출되는 시기보다는 그 외의 물질들이 발생될 때 함께 배출되는 상관관계를 보였다. 이러한 결과는 황화계 물 질이 주로 발생되는 단계에서는 사체가 중간 분해산물 로 분해되고, 중간 분해산물들이 메탄, CO2, 및 알데히 드, 유기산, 및 VOCs 등 비황화계 물질들로 분해되는 것으로 추정된다.

퇴비층의 높이별 세균군집-악취성상-환경인자에 대 한 주성분 분석한 결과를 Fig. 8에 제시하였다. 사용된 환경인자로는 ORP와 pH를 사용하였다. 3가지 인자들 (세균군집-악취성상-환경인자)에 따른 높이별 거동 특 성은 중단과 하단이 유사하였고, 상단은 다른 거동 특 성을 보였다. 이러한 결과는 상단의 경우 대기층으로부 터 공기가 확산되어서 유입되므로 사체가 분해시간에 따라 악취, 세균군집의 변화가 큰 것으로 사료된다.

4.결 론

본 연구에서는 돼지사체가 혐기적 고온 매몰퇴비화 법에 의해 분해되는 동안 우점 세균군집의 거동 특성 을 조사하였다. 또한, 매몰퇴비층의 높이별 세균군집변 화, 발생 악취, 세균군집-악취-환경인자의 거동 특성을 각각 PCA를 통해 상관관계를 분석하고, 발생되는 악 취물질과 세균군집구조 간의 상관관계를 주성분 분석 과 extended local similarity analysis를 하였다. 이를 통 해 다음과 같은 결론을 도출하였다.

이러한 상관성 분석 결과들은 사축의 처리 과정에서 세균군집과 악취발생과의 거동특성을 이해하고, 매몰지 의 악취 관리를 위한 유용한 정보로 활용이 가능하다.