1. 서 론
최근 코로나19에 의한 펜데믹, 2003년 사스, 2015년 메르스 등으로 인한 전염병 발생으로 실내공기의 중 요성이 강조되고 있다(Koo and Jang, 2020). 2000년대 이후로 산업화 도시화의 가속화, 생활환경과 생활패 턴의 변화(대부분의 사람들이 사무실, 지하공간, 각 종 실내업소, 학교 병원 등 다양한 실내공간에서 80% 이상 활동)로 인한 호흡기 질환, 알레르기 질환이 증 가하고 있어 실내공기 혹은 실외공기 관리에 대한 필 요성이 커지고 있다(Sohn et al., 2003;Lee et al., 2014).
우리나라 정부에서는 실내공기오염에 대한 대응을 해오고 있다. 1986년 보건복지부에서 “공중위생법”안 에 공중이용시설을 대상으로 위생관리기준을 정했으 며(Sohn et al., 2003), 1992년 건설교통부의 “건축설비 기본법”에서 환기설비의 공기질 관리 기준을 정하였 고(KARSE, 1986), 1996년에는 “지하생활공간공기질 관리법”을 제정하여 지하역사, 지하도 상가에 대한 실 내 공기질 관리를 하고있다. 2000년 이후로는 환경부 에서 “다중이용시설 등의 실내공기질 관리법”을 제 정하여 체계적인 관리를 실시하고 있다(Han, 2000). 현재에도 실내공기질 관리 기본계획을 통하여 다중 이용시설을 중심으로 관리를 강화하고 있다(Park, 2011). 이러한 방안들은 실내공기 혹은 실외공기와 사람의 건강 사이의 연계성 및 적정 대응의 필요성이 있음을 의미한다.
실내공기의 오염원인은 다양하다. 빌딩과 아파트 가 많아지고, 격리된 공간에서 하루의 90% 이상을 보 내는 것이 현실이며, 매일 접하는 생활용품, 애완동물 등 다양한 실내배출원과 공장 및 차량 배기가스 등 건 물주변의 외부 오염원 등이 있다(OPC, 2004;Siegel et al., 2022). 실내환경오염 물질에는 미세먼지 같은 입 자상 오염물질과 이산화탄소, 일산화탄소, 이산화질 소 같은 가스상 오염물질이 있다. 또한 건축자재에서 발생되는 휘발성유기화합물(VOCs)과 포름알데히드 (HCHO) 등이 유해물질로 인식되어 오고 있다. 환경 오염물질들은 건강에 영향을 줄 수 있으며, 보건학적 증상으로는 눈, 코, 후두의 점막에 대한 자극 및 건조 증상, 피부의 홍반, 두드러기, 습진, 두통, 기관지 천 식, 구토 등이 보고되고 있다(Maciag and Phipatanakal, 2022).
최근 10년간 휴먼 마이크로바이옴에 대한 연구가 활발해지고, 연구결과가 축적되면서 스킨 마이크로 바이옴, 호흡기 마이크로바이옴에 대한 관심이 점차 커지고 있다(Kelly, 2017;Gopalakrishnan et al., 2018;Ma et al., 2018;Lee et al., 2022). 주변환경과 사람의 항 상성 유지는 밀접하게 연관성이 있다. 따라서 실내공 기내 존재하는 생물학적인 유해인자에 관심이 높지 만 이들 유해인자들과 휴먼 항상성 유지에 대한 연관 성을 보여주는 연구결과는 거의 없는 실정이다. 일반 적으로 실내공기에 존재하는 부유세균들은 Micrococcus 속, Bacillus속, Staphylococcus속, Corynebacterium속 등 이 90퍼센트 이상을 차지한다고 보고되고 있다(Maciag et al., 2022). 그러나 기존의 연구들은 다중이용시설 관 리법에 의거해서 음식점, 대형병원, 유치원과 노인요 양시설에 집중되는 것이 현실이다(Jeon, 2011;Jeon and Hwang, 2015;Kim Susan et al., 2021).
한편 국내 실내공기질 관리법에서 권고하는 부유 미생물 농도 기준은 실내 공기중 다양한 균종에 대한 세밀한 검토를 통해 보완되어야 한다. 이것은 다양한 부유 미생물의 분포와 특성에 대한 연구가 필요하다 는 것을 의미하는 것이다. 특히, 인구노령화 등에 따 라 데이케어센터 등의 확대 등 면역저하계층의 건강 에 영향을 미치는 균주에 대한 분석은 보다 정밀한 실 내공기질 관리 및 환경보건정책마련에 도움을 줄 수 있다(Oh et al., 2014).
본 연구에서는 그동안의 국지적인 연구와 다른 대 한민국 전역에 걸쳐 다중이용시설의 실내 공기중 부 유미생물 분포를 확인하고 다중이용시설에서 유해인 자의 분포 및 특성을 분석하여 환경건강영향에 미치 는 영향을 분석하고자 하였다.
2. 연구방법
2.1 실내 공기중 부유세균의 포집
부유세균 수집은 미생물 샘플러(KAS-110, 켐익코 퍼레이션)를 사용하여 1 m 반경에 장애물이 없고 인 체에 직접적 노출이 가능한 지표에서 1.3 m 높이에서 100 L의 실외 공기를 포집하여 추출된 균주를 배양 시 험하였다. 포집은 서울, 경기, 강원, 대전, 광주, 부산, 제 주 7개지역에서 2021년 10월에서 2022년 5월 사이에 실시하였다. 포집에 사용된 배지는 TSA (Tryptic Soy Agar) 배지로 각각 1회 포집하였다. TSA 플레이트는 28°C 항온배양기에서 3일동안 배양하고 부유세균의 검출빈도를 측정하였다. 측정된 플레이트는 염기서 열을 이용한 군집분석에 사용하였다.
2.2 실내공기 부유세균 유전자 염기서열을 이용한 군 집분석
실내공기에서 포집한 모든 균주를 일동안 28°C에 서 배양한 후 부유 세균을 새로운 TSA agar 플레이트 에 다시 옮겨서 순수 배양하였다. 순수 배양된 부유 세균은 솔젠트 Co.LTD.에서 동정하였다. 부유 세균 동 정을 위하여 사용한 서열은 16S rDNA의 27F/1492R primer set였다. 분석된 부유 세균(3,805 종)을 지역별, 다중이용시설별로 마이크로소프트 엑셀 소프트웨어 에서 매칭하고, 분류를 하였다. 이어서 분류된 부유 세 균의 군집계통분석을 위하여 NCBI taxonomy database 를 이용해여 phyloT online tool (http://phylot.biobyte. de)에서 지역별 또는 다중이용시설별 Newick format 으로 변환하고, iTOL online tool (http://itol.embl.de)을 사용하여 계통분석도를 작성하였다.
2.3 피부표피세포주의 배양
인체피부세포주 HaCaT cell은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였 으며 10% FBS, penicillin (100 units/mL)과 streptomycin (100 μg/mL)이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37°C, 5% CO2 조건의 incubator에서 배양하였다. 모든 실험 과정에서 세포는 80%~90%의 confluence 범위에 도달 하도록 배양하여 사용하였다.
2.4 MTT assay
세포 생존율을 측정하기 위해 인체피부세포주(HaCaT cell)를 96 well plate에 1×104 cells/well로 분주하여 24 시간 배양한 후에, 균주를 108 cfu/mL로 처리한 뒤 24 시간 배양하였다. 배양 배지는 걷어내고 PBS (phosphatebuffered saline)로 세척한 세포에 MTT (Sigma chemical Co., St. Louis, MO, USA)용액을 최종농도 0.5 mg/mL 으로 첨가하여 37°C에서 2시간 반응시킨 후 생성된 formazan을 DMSO로 녹여 microplate reader (Spectra Max Plus384, Molecular devices, San Jose, CA, USA) 를 사용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였 다. 세포 생존율은 대조세포(control)에 대한 백분율 로 다음과 같은 수식에 의해 계산하였다 [cell viability (%) = 100 × (absorbance of treated sample)/(absorbance of control)]. 유효 독성 여부는 세포생존율 80%를 기 준으로 판별하였다.
2.5 통계분석
피부독성평가 시험은 3회 반복하여 진행하였으며 각그룹간 평균 차이를 검증하기 위하여 SPSS version 23.0 (SPSS Inc., USA)를 이용한 일원분산분석을 사용 하였다. 유의성은 신뢰구간 p < 0.05 수준에서 검정하였다.
3. 결과 및 고찰
인구밀집지역인 서울, 대전, 부산, 광주, 경기, 강원, 제주 7개 지역의 다중이용시설을 대상으로 실내공기 를 측정하여 생물학적 유해인자의 특성과 세포주를 활용한 독성평가를 수행하였다. 서울 특별시의 경우 모두 1078곳(경기도, 705곳; 강원도, 847곳; 대전광역 시, 288곳; 부산광역시, 373곳; 광주광역시, 265곳; 제 주도, 249곳)을 대상으로 측정을 하였다. 이 자료를 바 탕으로, 다중이용시설은 건축법 시행령에 규정된 명 칭으로 통일하여 분류하고 통계처리를 하였다. 실내 공기를 측정한 장소는 일반음식점, 소매점, 대중교통, 소매시장, 공동주택, 지하주차장, 금융업소, 업무시설, 교육연구시설, 그리고 공중화장실에서 측정되었다.
국내지역별 평균 부유세균농도는 지역별로 약간의 차이를 보이긴 하였으나 기준치(800 CFU/m3)를 초과 하지 않았다(Fig. 1). 특히 일반적으로 실내부유세균 오염이 주의되는 기관들인 병원 및 공공기관 등의 실 내부유세균농도보다 사무실, 지하주차장, 공공화장실 등의 부유세균농도가 높은 특성이 주목할 만하며 이 것은 실내 공기질에 대한 집중적 관리가 실시되는 곳 의 실내공기질이 상대적으로 양호한 것으로 평가될 수 있다(Fig. 2). 단, 이 연구의 조사기간은 우리나라에 코로나19가 유행하는 시기와 겹쳐있어 대부분 사용 자들이 마스크를 사용하고, 국내외적으로 오염물질 배출기관 산업체의 활동이 줄어 미세먼지 농도 등 오 염물질 농도가 급격히 줄어들었고 사회적 거리두기 가 시행되어 일반활동이 제한된 기간과 겹쳐있어 포 집되는 지역의 측정치가 평년에 비하여 낮은 점이 고 려되어야 한다. 현재 이를 보정하기 위한 적절한 기 준이 없어 본 연구에서의 기준치 이하의 실내 부유세 균 농도의 절대치 값보다는 상대적으로 국내전역에 분포하는 실내공기 부유세균의 분포와 특성에 대한 이해를 도모하는데 주안점을 두고 연구하였다.
전국적으로 170속 768종의 부유세균이 검출되었다. 검출된 부유세균을 지역별과 다중이용시설 실내공기 에서 검출된 부유세균을 직접 배양하여 균주정보를 분석하였다(Fig. 3). Fig. 3A의 경우는 각지역에서 검 출된 부유세균을 속별로 분류하여 퍼센트로 나타낸 것이다. 서울 특별시의 경우 Micrococcus sp. (21.48%), Bacillus sp. (8.6%), 그리고 Arthrobactor sp. (7.7%) 의 순으로 분포하였다. 나머지 지역의 대표적인 출현 종 균은 다음과 같다: 경기도, Micrococcus sp. (13.76%), Arthrobactor sp. (8.9%), 그리고 Bacillus sp. (8.7%); 강 원도, Micrococcus sp. (11.25%), Arthrobactor sp. (8.81%), 그리고 Staphylococcus sp. (8.4%); 대전 광역시, Bacillus sp. (12.41%), Micrococcus sp. (10.45%), 그리고 Microbacterium sp. (7.51%); 부산광역시, Micrococcus sp. (22.85%), Staphlyococcus sp. (9.35%), 그리고 Bacillus sp. (8.31%); 제주도, Arthrobactor sp. (9.62%), Micrococcus sp. (9.62%), 그리고 Microbacterium sp. (7.31%).
전체적으로 가장 많이 검출된 종균들은 Micrococcus sp., Arthrobactor sp., 그리고 Bacillus sp. 였으며, 특이적 으로 부산 대전 광주에서 Staphylococcus sp., Microbacterium sp.가 상대적으로 높은 검출빈도를 보였다. 가장 많이 검출된 종은 Micrococcus 속의 경우, M. yunnanensis, M. antarcticus, M. luteus였으며, Arthrobactor sp.는 A. bussei, A. crystallopoietes, A. oryzae; Bacillus 속은 B. infantis, B. cereus, B. aryabhattai가 포함되어 있었다(Fig. 3a). Fig. 3A에서 나타난 바와 같이 지역별 로 부유세균을 속을 기준으로 분류했을 때, M. yunnanensis만이 모든 지역에서 80%의 비율로 가장 많 이 검출되었고, A. bussei는 서울 경기 강원에서 40%가 검출되었다. 나머지 Micrococcus속과 Arthrobactor속 그 리고 Bacillus 속의 경우는 10%의 비율로 검출되는 것 을 볼 수 있었다.
또 다중이용시설에 따라 분포하는 부유세균의 패 턴은 비슷하였고 Micrococcus속, Arthrobactor속, 그리 고 Bacillus속이 지역별 분류에서 나왔던 결과와 일치 하는 것을 볼 수 있었고 밀집도가 높은 음식점과 대 중교통 등의 기관일수록 부유세균 다양성이 더 크게 나타났다(Fig. 3B).
Fig. 4는 각 시도별 및 다중이용시설별로 1회 이상 검출된 실내공기 부유세균의 계통분석을 실시한 결 과이다. 시도별 분류에서 그람음성균은 Pseudomonas 속, Rosemonas속, Acinetobacter속 Brevundimonas속, 그리고 Moraxella속이 검출되었지만 이들의 검출 퍼 센트는 10%이하였다. 검출된 대부분의 실내공기 부 유세균은 그람양성세균임을 알 수 있었다. 그리고 검 출된 그람양성세균은 Micrococcus속, Arthrobactor속, Staphylococcus속, Microbacterium속, Rhodococcus속, Chryseobacterium속, Brevibacterium속, Curtobacterium 속, Pseudarthrobacter속, Streptomyces속, Staphylococcus 속, Paenibacillus속이였다. 이들 대부분의 그람양성 부 유세균의 경우는 병원성을 가지고 있지 않은 것으로 알려져 있으며, 병원성이 알려진 미생물은 5% 이하 로 검출되는 경향을 보였다.
전국을 대상으로 유동인구가 많은 장소에 생물학 적 유해인자의 존재유무를 파악하여 전 국민의 쾌적 한 생활환경을 위한 정보를 제공하기 위한 목적에서, 각각의 장소에서 검출된 실내공기 부유미생물를 분 리 배양하여 이들의 알레르기 관련 독성 및 염증반응 의 영향을 인체 피부세포(Hacat cell)를 통하여 시험하 였다. 이는 부유미생물이 아토피피부염등의 환경질 환에 영향을 주는것과 호흡기 세포등에 미치는 영향 을 간접적으로 확인하는데 도움을 줄 수 있다(Choi et al., 2017). 우선 전국에서 포집, 추출, 배양된 40 종의 부유세균을 피부세포의 활성 및 염증에 관여하는 인 체피부세포에 처리하여 세포증식에 영향을 주는지 시험하였다.
Fig. 5에서 보이는 결과처럼, 40개의 부유 미생물 대부분은 세포증식에 영향을 주지 않았지만 10종 (Arthrobacter sp., Bacillus sp., Brachybacterium sp., Brevundimonas sp., Kocuria sp., Mammaliicoccus sp., Norcardia sp., Prestia sp., Psychrobacillus sp., Rhodococcus sp.)들은 인체피부세포의 세포증식을 억제하는 경향 을 보였다. 이 결과는 이들 세균의 경우 큰 병원성은 없는 것으로 알려져 있고, 전국에서 포집된 부유미생 물의 검출 빈도수 또한 2%~10%로 비교적 낮은 비율 에 해당하지만, 위해성 측면에 대한 판단은 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
4. 결 론
실내공기질의 위해 관리 지표로서 생물학적 유해인 자중의 하나인 부유세균의 영향평가하기 위하여 우리 나라 전역(서울 특별시, 경기도, 강원도, 대전광역시, 광주광역시, 부산광역시, 제주도)을 대상으로 하여 포 집 추출 배양한 부유세균을 분석하였다. 국내에서 서 식하는 부유세균의 종류는 모두 170속 768종의 부유 세균을 검출하였으며, 100곳 이상에서 검출된 부유세 균은 Micrococcus sp. (15.76%), Bacillus sp. (15.76%), Arthrobacter sp. (9.17%), Microbacterium sp. (7.8%), Staphylococcus sp. (6.22%), Kocuria sp. (6.09%), Pseudarthrobacter sp. (5.72%), Pseudomonas sp. (3.07%), Brevundimonas sp. (2.76%)이였다. 포집 검출 배양하여 실험에 사용한 부유세균은 모두 40종이였다. 알레르 기 면역질환에 관련있다고 예상되는 세균은 Brevundimonas bullata, Chryseobacterium taihuense, Dietzia cinnamea, Exiguobacterium acetylicum, Lysinibacillus pakistanensis, Microbacterium testaceum, Roseomonas mucosa이였으며, 이들의 검출빈도는 각각 0.15%, 0.02%, 0.05%, 0.26%, 0.03, 1.4%, 1.68%이였다. 시험한 부유세균의 대부분은 인체세포주에서 세포증식에 영 향을 주지 못하는 것으로 확인되었으며, 일부 부유세 균(실내공기 부유세균 종류의 약 25%)은 HaCat 피부 세포의 세포증식을 저해하는 것으로 나타났다. 이는 실내부유세균에 노출이 되었을 경우, 피부염증에 영 향을 줄수 있는 가능성을 제시하며 향후 실내공기중 개별균주를 대상으로 인체건강영향에 대한 심도있는 분석연구가 필요하다.
