1. 서 론
버섯은 국민식생활 향상과 웰빙이라는 타이틀을 가 지고 있다. 느타리버섯은 국민들이 쉽게 접할 수 있 는 중 식용으로 많이 알려진 버섯이다. 느타리버섯은 분류학적으로 담자균아문(Agaricomycotina), 주름버 섯목(Agaricales), 느타리과(Pleurotaceae), 느타리버섯 속(Pleurotus)에 속한다. 느타리버섯은 혈중콜레스테 롤이나 면역력 강화나 항치매, 항암작용, 항산화 등 다 양한 활성이 있는 것으로 알려져 있다(Adebayo and Oloke, 2017;Han et al., 2019;Dicks and Ellinger, 2020). 이러한 버섯을 산업적으로 생산하기 위해서는 안정적인 버섯의 재배 생산이 중요하다. 느타리버섯 의 재배방식에는 균상, 병, 봉지 재배방식이 있다. 버 섯이 재배되는데 재배사는 보온 덮개 간이버섯재배 사나 양지붕 형태의 샌드위치 단열 패널재배사에서 재배되고 있다(Lee et al., 2019). 성공적 버섯 재배를 위 해서는 재배가 이루어지는 시설내의 온도나 습도 등 물리적 환경 관리가 중요하다. 재배사의 부유미생물 또한 생물학적 환경 관리 대상으로 중요하다. 부유미 생물은 식품 오염균, 버섯 해균, 재배자 건강에 영향 을 끼치는 병원균 등으로 나타나므로 부유미생물의 농도가 높으면 성공적인 버섯 재배가 어려울 수 있다
버섯 재배사는 습도가 높고 버섯을 키우기 위한 유 기물 배지가 존재하는 바 미생물이 번식하기 쉬운 환 경이다. 이에 따라 버섯 재배사 위생과 관련하여 재 배사내 부유세균에 대한 조사가 이루어져 왔다. 표고 버섯 재배사의 연구에서는 2년간 재배실 실내환경 연 구를 진행하였는데 해 마다 부유하는 세균의 종류가 달라진다는 결과가 나왔다(Noh et al., 2021). 양송이버 섯 재배사 연구에서는 재배실에 존재하는 버섯 배지 로 연구를 진행 결과 배지에서 인체병원성 균이 검출 되었다(Kwon et al., 2015a). 버섯 배지에서 검출된 세 균은 재배사 공간에서 부유세균으로 존재할 수 있기 때문에 버섯배지에 대한 추가적인 연구가 필요하다 는 결과도 나왔다(Kwon et al., 2015b). 이처럼 부유미 생물에 대한 영향을 고려하여 부유하는 미생물을 포 집하는 필터에 대한 연구도 수행되었다. 필터를 교체 후 시간이 흐름에 따라 부유하는 미생물 농도를 조사 한 결과 농도가 점차적으로 6개월에 이르기까지 증 가하였다(Park et al., 2020). 이러한 보고들은 부유미 생물 관리의 중요성을 보여주고 있다.
산업화 이후로 지구온난화는 전 세계적으로 진행 되고 있는 가운데 최근 기후온난화 영향으로 국내의 기후도 점차 아열대성 기후가 나타나고 있다. 지난 106 년 동안 우리나라의 계절 시작일은 봄은 13일, 여름은 10일 빨라지고, 가을과 겨울에는 각각 9일, 5일이 늦 어진 것으로 보고되었다(NIMS, 2018). 이에따라 계절 여름 기간은 98일에서 117일로 19일 길어졌고 겨울은 109일에서 91일로 18일 짧아졌음을 알 수 있다. 이러 한 우리나라의 계절 기간과 기온 상승 변화는 여러 면 에서 농업에 영향을 주고 있다. 특히 기온 상승과 여 름이 길어지면서 고온이 지속되는 날이 늘어남에 따 라 기온에 민감한 버섯의 재배가 영향을 받을 수 있 을 것으로 예측되고 있다. 이러한 예측에 맞추어 고 온에서 재배가 가능한 고온성 버섯을 육종하거나 고 온에서 재배가 가능한 새로운 버섯 작목의 개발이 시 도되고 있다. 이러한 육종 연구와 작목 개발 연구를 위해 서로 다른 온도 조건에서 버섯 재배 연구가 수 행되고 있다. 그러나 아직 국내에서 서로 다른 온도 조건에서 부유세균이 어떻게 분포하는지에 대한 조 사 연구는 없는 실정이다. 본 연구는 고온성 버섯 재 배사 실내환경의 기초자료를 얻고자 온도가 다른 느 타리버섯 재배실에서 부유세균의 종 동정과 농도를 실시하였다.
2. 재료 및 방법
2.1 느타리버섯 재배사 온도, 습도 및 부유세균 측정
본 연구는 서로 다른 온도에서 느타리버섯을 재배 하기 위해 버섯 재배실의 실내온도를 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C로 설정한 장소를 대상으로 수행하였다. 버 섯 생육기 중반 시점인 2022년 4월과 5월에 각 버섯 재 배실의 온도와 습도를 측정하고 동시에 실내공기를 포집하여 부유세균을 분석하였다. 온도와 습도는 Testo (Testo 610, Testo AG, Germany) 온도측정기를 사용하 였다(Fig. 1). 실내공기 중 부유세균 측정은 Anderson sampler (Al-Doory, 1970) 공기포집기(Single Stage Ambient Viable Sampler, Model 10-880, Tisch Environmental, Cleves, OH, USA)를 사용하여 환경부의 실내 공기질공정시험방법에 따라 충돌법으로 측정하였다 (Fig. 1). Sampler의 측정 기기의 흡입 유량은 28.8ℓ/ min로 1분간 작동하였다. sampler의 높이는 70 cm ~ 100 cm에서 수평을 맞추고 각 온도재배실 마다 3반복 하여 측정하였다. 부유세균 측정 시 세균의 배양이나 저장 용도로 사용되는 TSA (Tryptic soy agar, Oxoid, UK) 고체배지에 항진균제 benomyl을 100 ppm 농도로 첨가하여 사용하였다. 측정에 사용한 공기중 세균 포 집 배지 시료는 파라필름으로 봉하고 쿨러에 담아 실 험실로 가져와 25°C 배양기에서 3일 ~ 4일간 배양하 였다. 배지에 자라난 세균의 농도를 알기 위해 배지 에 자라난 세균 균총을 균총계수기로 계수하고 유량 을 계산하여 부유세균 농도(CFU/m3)를 계산하였다. 세균 종 분석을 위해서는 배지에 자란 콜로니의 색, 모양, 번지는 형태 등을 관찰하여 서로 다르게 보이 는 colony를 선택하여 새로운 TSA 배지에 획선도말법 (Streaking)으로 접종 후 계대배양을 통해 순수분리를 진행하였다.
2.2 세균 DNA 추출 및 동정
순수분리 된 세균의 배양을 위해 고체배지에서 자 란 single colony를 따서 Conical Tube 50ml(SPL 50050)에 담겨있는 TSB (Tryptic Soy Broth) 액체배지 에 접종 후 25°C 암조건에서 shaking 인큐베이터로 24 시간 배양하였다. 배양한 세균은 광학현미경(Axioskop 40, Carl Zeiss, Germany) × 400 시야에서 세균의 세포 학적 형태를 관찰하였다. 종분석을 위해서는 TSB에 배양된 세균배양액을 1.5 ml tube에 옮겨서 3,000 rpm 에서 10분간 Centrifuge를 진행 후 상등액은 버렸다. 남겨진 pellet은 살균 증류수로 한번 세척하고 Bioneer 사의 AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit를 사 용하여 Genomic DNA를 추출하였다(Kim et al., 2021). 추출은 회사에서 제공하는 Protocol에 따라 수행하였 다. 추출된 DNA를 template로 하여 세균의 동정에 사 용되는 barcode DNA 인 16S rDNA를 Polymerase Chain Reaction (PCR)로 증폭하였다. 세균 동정은 앞 서 보고된 방법(Ahn et al., 2017;Kim et al., 2014)과 동일한 방법으로 분자동정을 수행하였다. 이 때 세균 16S rDNA 특이 Universal Primer인 27F (5'-AGAGTT TGATYMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-TACGGYTAC CTTGTTACGACT-3')를 이용하여 증폭하였다(Hou et al., 2018;Lane, 1991)을 사용). 기대하는 크기의 DNA 의 증폭 유무를 확인하기 위하여 PCR 증폭산물은 1% Agarose gel 전기영동으로 확인하였다(Kwon et al., 2015a). DNA 밴드 확인 후 종 동정을 위해 바이오닉 스사(Dajeon, Korea)에 염기서열 분석을 의뢰하였다. 결정된 염기서열은 EzBioClaud (http://www.ezbiocloud. net/eztaxon) 프로그램을 이용하여 염기서열 유사도 를 확인하여 동정하였다. 세균의 계통분류학적 분석 을 위해서 비교할 reference 세균들의 16S rDNA 염기 서열은 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) database로부터 다운받아 CLUSTAL W program으로 다중 염기서열정렬을 진행하였다(Thompson et al.,1994). 동 정된 세균 간의 유연관계 확인을 위해 정렬된 서열은 MEGA ver. 6.0 프로그램을 이용하여 분자계통수를 작 성하였다(Saitou and Nei, 1987;Tamura et al., 2013). 계통수 가지의 신뢰도 평가는 bootstrap resampling을 1,000번 반복하여 수행하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 느타리버섯재배사 실내 온도 및 습도 조사
4월과 5월 느타리버섯 온도 별 재배사의 재배실 온 도를 측정하였을 10°C 설정된 재배실의 평균온도는 11.85, 15°C로 설정된 버섯실의 평균온도는 16.9°C, 20°C 설정된 30°C 재배실 평균온도는 21.6°C, 25°C로 설정 된 재배실 평균온도는 23.85°C, 30°C로 설정된 재배실 균온도는 25.9°C로 측정되었다(Fig. 2). 측정 결과를 비 교해 보면 10°C, 15°C, 20°C로 설정된 버섯재배실 온 도는 설정된 온도보다 조금 높았으며 25°C, 30°C로 설 정된 버섯재배사는 설정된 온도보다 2°C~5°C 정도 낮 았다. 습도의 경우는 10°C 설정된 재배실 평균습도는 53.95%, 15°C로 설정된 재배실 평균습도는 69.35%, 20°C 설정된 재배실 평균습도는 62.45%, 25°C로 설정 된 재배실 평균습도는 79.4%, 30°C로 설정된 재배실 평균습도는 71.05%로 측정되었다(Fig. 3). 습도는 각 온도 별 버섯재배실에 똑같이 60%~99% 사이인 습도 로 고정하였는데 10°C 재배실을 제외하고는 이 범위 안에 있는 습도로 측정되었다.
3.2 느타리버섯 재배사 실내공기 중 부유세균 농도
온도 별 재배사의 실내의 부유세균을 4월에 측정한 결과 10°C 재배실에서 2.06 × 102 CFU/m3, 15°C 재배실 에서 2.77 × 102 CFU/m3, 20°C 재배실에서 2.77 × 102 CFU/m3, 25°C 재배실에서 1.61 × 102 CFU/m3, 30°C 재배실에서 3.67 × 102 CFU/m3 로 각각 측정되었다(Fig. 4). 대체적으로 4월의 경우 30°C 재배실에서 살짝 다 른 온도의 재배실 보다 높았다. 그 이외의 재배실에 서 부유세균 농도는 큰 차이는 없이 모두 환경부의 다 중이용시설 실내공기질 유지기준인 8 × 102 CFU/m3 보다 낮게 존재하였다. 반면에 5월에 측정한 세균농 도는 10°C 재배실에서 1.05 × 103 CFU/m3, 15°C 재배실 에서 7.47 × 102 CFU/m3, 20°C 재배실에서 7 × 103 CFU/ m3, 25°C 재배실에서 7 × 103 CFU/m3, 30°C 재배실에 서 5.47 × 102 CFU/m3 이었다(Fig. 4). 전체적으로 4월 보다 5월에 부유세균 농도가 5개 서로 다른 온도의 재 배실 모두에서 증가하였다. 특히 10°C 재배실, 20°C 재 배실, 25°C 재배실의 경우 환경부 실내공기질 유지기 준인 8 × 102 CFU/m3를 초과하였다. 특히 20°C 재배 실, 25°C 재배실의 경우는 기준치를 8.75 배 초과하였 다. 이러한 결과는 느타리버섯 재배사의 재배실 부유 세균의 농도가 시기에 따라 급격히 변화할 수 있음을 보여주는 동시에 재배사 온도가 다르면 부유세균의 농도도 크게 달라질 수 있음을 시사한다. 5월 측정 자 료를 보면 재배실의 습도가 4월에 비해 감소한 10°C 재배실과 20°C 재배실에서 부유세균의 농도는 줄지 않고 크게 증가하였다. 이는 습도가 50% 이상이면 부 유미생물이 충분히 크게 증가될 수 있음을 보여준다. 따라서 비록 습도가 세균 증식에 중요하지만 50% 정 도의 낮은 습도가 부유세균 오염도 증가를 억제하는 변수는 아닌 것으로 사료된다. 이전에 조사된 표고 재 배사 부유세균 조사 보고에서도 21개 재배사 중 15개 재배사에서 8 × 102 CFU/m3를 초과하였다(Ahn et al., 2017). 이는 버섯 재배사의 실내공기 중 부유세균 농 도가 빈번히 유지기준치를 초과하여 오염도가 높아 질 수 있음을 보여준다. 이에 따라 느타리버섯 재배 사의 재배실에서도 공기질 관리가 적절하게 이루어 져야 할 것으로 사료된다.
3.3 부유세균의 동정 및 특성
TSA배지에 획선평판법을 이용해 순수분리 된 세균 을 나타난 형태는 Fig. 5와 같다. 이렇게 순수분리 된 세균에 대하여 16S rDNA를 이용해 분자적 동정을 진 행하였을 때 느타리버섯 온도 별 재배사에서 순수분 리 된 총 세균은 15속 20종이 동정되었다(Table 1). 동 정된 세균에 대해 분자계통도를 16S rDNA염기서열 을 기반으로 작성한 결과는 Fig. 6과 같다. 분류학적으 로 볼 때 Actinomycetia문에서 7종, Bacilli문에서 6종, Betaproteobacteria 1종, Gamma-proteobacteria 1종, Alpha-proteobacteria 4종, Sphingobacteria 1종으로 분 류되었다. 분류 속(Genus) 수준에서는 10°C 재배실에 서는 4개의 속이 동정되었고 15°C 재배실에서도 4개 의 속이 동정되었다. 20°C 재배실에서는 6속이 동정 되었고 25°C 재배실에서는 10°C와 15°C 재배실의 결 과처럼 4개의 속이 동정되었다. 30°C 재배실에서는 다 른 온도의 재배실보다 많은 9개 속이 동정되었다. 느 타리버섯 온도 별 재배사에서 동정된 세균을 보았을 때 Microbacterium 속이 많이 차지하였고 그 다음으로 는 Priestia, Kocuria, Sphingomonas 속이 공통적으로 많 이 차지하였다.
분리 동정된 균주의 종 특성을 조사하였을 때 인체 병원성 균주가 존재하였다. Agrobacterium radiobacter 종은 균혈증, 복막염 등의 질병을 일으키는 일으킬 수 있다(Amaya and Edward, 2003). Brevundimonas vesicularis 종은 균혈증(Shang et al., 2012), 심내막염(Yang et al., 2006), 패혈성관절염(Sofer et al., 2007)을 일으킨 다고 보고되었다. Kocuria palustris는 기회감염균이고 비타민 A 결핍시 각막염을 유발한다(Mattern and Ding, 2014). K. palustris와 같은 속인 K. salsicia는 B. vesicularis처럼 균혈증을 일으킨다(Yun et al., 2011). Lysinibacillus fusiformis와 Sphingobacterium siyangense 종도 균혈증을 일으킨다고 알려졌다(Nemoto et al., 2019;Morioka et al., 2022). Moraxella osloensis는 균혈 증과 복막염(Yamada et al., 2019), 골수염(Sugarman and Clarridge, 1982)을 일으킨다. 각 동정된 세균들이 대부분 공통적으로 균혈증을 유발하는 특징이 있었 다. 동정된 세균 중에 Brevibacterium frigoritolerans는 곰팡이에 의한 옥수수 뿌리썩음병 방제에 효과가 있 는 보고가 있다(Batool et al., 2019).
4. 결 론
본 연구는 재배실의 실내온도를 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C로 설정하여 느타리버섯을 재배를 하면서 서로 다른 온도 조건에서 부유세균이 어떻게 분포하 는지에 대해 4월과 5월에 각각 조사하였다. 부유세균 농도는 4월에 1.61 × 102 ~ 3.67 × 102 CFU/m3 5월에 5.47 × 102 ~ 7 × 103 CFU/m3 범위로 분포하였다. 5월에 10°C, 20°C, 25°C 재배실에서 우리나라 실내공기질 유 지기준치(8.0 × 102 cfu/m3)를 초과하였다 세균 농도는 4월 대비 5월 크게 증가하였다. 세균 농도는 온도가 다 른 재배실 간에 차이가 있었다. 그 차이는 4월 보다 5 월 더 뚜렷하였다. 실내 공기에서 총 15속 20종이 분 리 동정되었다. 전체적으로 Actinomycetia문에서 가 장 많이 존재하였다. 이중 Agrobacterium radiobacter, Brevundimonas vesicularis, Kocuria palustris, K. salsicia, Lysinibacillus fusiformisSphingobacterium siyangense 이 인체 건강에 영향을 미치는 종으로 조사되었다. 이 것은 느타리버섯 재배 이용되는 서론 다른 온도의 재 배실에서 공기 중 세균에 대한 첫 보고이다. 본 연구 결과는 고온성 버섯 재배사 실내환경을 이해하는데 기초자료로서 활용이 기대된다. 재배사 환경 위생과 관련하여 향 후 유해 세균의 출처를 파악하고 이들의 농도가 증가하지 않도록 하는 관리하는 방법에 대한 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다
