1. 서 론
버섯은 국민식생활 향상과 웰빙 식품으로써 다양한 분야에서 상업적으로 사용되고 있다. 특히 목이버섯 (Auricularia heimuer)은 국내에서 식용 및 약용으로 인기가 높은 버섯 중 하나로, 식이 섬유와 비타민D가 풍부한 것으로 알려져 있다. 이러한 버섯을 재배하는 시설인 재배사의 실내 환경은 버섯의 종류에 따른 생육특성에 의하여 대부분 습하고 다소 무더우며, 몇몇 재배사는 어두운 특수 환경을 지니고 있다(Lee et al., 2018). 또한 목이버섯의 자실체를 생육하는 톱밥배지는 유기물 함량이 풍부한데, 이러한 환경들은 버섯 뿐만 아니라 외부 세균이 증식하기에도 적합한 환경을 제공하고 있다.
공기중에 부유하는 세균은 버섯 재배사의 위생에 영향을 미치는 중요한 환경요인 중 하나이다. 이들 세균은 배지오염, 버섯 병원체, 식중독 원인균, 인체병원균으로 작용할 수 있어 버섯의 품질을 하락시키거나 버섯을 재배하는 재배자의 건강에 영향을 주거나 버섯을 섭취한 소비자의 건강에 영향을 미치는 원인균이 될 수 있다. 특히 부유세균의 경우 어린이나 노약자와 같이 면역력이 약한 사람의 건강에 쉽게 영향을 줄 수 있기 때문에 환경부의 실내공기질관리법에서는 다중이용시설 중 의료시설, 노인요양시설, 산후조리원, 어린이집 등 민감 시설에 대해 총부유세균 유지기준을 800 cfu/㎥으로 지정하였다(https://cleanindoor.seoul.go.kr/contents.do?contentsNo=32&menuNo=193). 버섯재배사는 온도와 습도가 높고 유기물이 많아 세균이 번식하기 쉬운 환경이다. 따라서 버섯 재배사내의 환경위생으로서 공기중 부유세균의 농도와 종 다양성 조사는 재배사 관리와 식품 안전, 소비자와 재배자의 건강에 있어서 중요하다(Noh et al., 2021).
오늘날 지구온난화의 진행으로 전세계적으로 기온이 상승하고 있으며 국내 또한 아열대성 기후로 점차 변해가고 있다(Park et al., 2020). 이러한 기후변화는 버섯 재배사내 공기중 존재하는 미생물상을 변화시키는 등 환경 변화에도 영향을 끼치고 있지만 아직 표고, 느타리, 양송이 등의 재배사를 제외하고는 부유세균에 대한 지속적인 연구 조사가 부족한 실정이다(Kim et al., 2014;Ahn et al., 2017;Jung et al., 2022;Kwon et al., 2015). 따라서 본 연구는 국내 목이버섯 재배사의 실내 온습도를 측정하고 재배사내 부유세균을 분리 동정함으로써 재배사내 실내환경에 대한 미생물 기초정보를 마련하고자 수행되었다.
2. 재료 및 방법
2.1 조사 지역 및 기간
본 연구는 국내 목이버섯 재배사 중 톱밥배지 (Sawdust-based media)를 사용하는 3지역(전북 익산시 금마면, 전남 완도군 군외면, 전남 완도군 고금면)에 소재하는 3곳 재배사에서 조사를 수행하였다. 이들 재배사는 육종된 목이 품종을 시험 재배하는 곳으로 재배환 경에 신경을 써야하기 때문에 조사지로 선정하였다. 목이버섯의 자실체 형성 후반 시점인 2022년 6월에 각 재배사의 온도와 습도를 측정하고 실내공기를 포집하여 부유세균을 분석하였다(Table 1).
2.2 재배사내 온습도 측정 및 시료 채집
각 재배사 내의 실내 온도와 습도는 입구, 중앙, 출구 세 구간으로 나누어 5분간 측정하였으며 Testo (Testo 610, Testo AG, Germany) 온습도 측정기를 사용하여 오후 시간대에 측정하였다(Fig. 1). 재배사내 부유 세균을 측정하기 위해 환경부 실내공기질공정시험기준에 따라 충돌법에 기반한 총부유세균 측정방법으로서 Anderson sampler (Single Stage Ambient Viable Sampler, Model 10-880, Tisch Environmental, Cleves, OH, USA)를 사용하여 재배사내 실내공기를 포집하였다(Fig. 1). Sampler의 경우, 28.8L/min 유량으로 1분동안 작동하였고, 측정위치는 각 재배사의 입구와 출구를 기준으로 정가운데 지점의 1.3m 높이로 설치하여 측 정하였다(Ahn et al., 2017). 모든 측정은 3반복으로 진행하였었다. 부유세균 포집에는 TSA (Tryptone Soya Agar)에 항진균제인 베노밀(Benomyl)을 100㎍/㎖ 농도로 넣어준 배지를 사용하였다. 공기 포집을 완료한 배지는 파라필름(Parafilm)을 이용하여 밀봉하고 아이스박스에 담은 상태로 이동하였다. 포집된 균 배양은 25℃ 배양기에서 3일 ~ 5일간 배양하였다. 배지에 자라난 균의 콜로니 수를 계수하기 위하여 균총계수기를 사용하였고 측정유량과 측정시간을 통해 부유세균의 농도(cfu/㎥)를 계산하였다. 배지에 형성된 균 콜로니의 모양과 색, 투명도, 가장자리, 광택 등 형태학적 특징을 비교하여 서로 다른 종을 새로운 배지에 순수분리 하였다. 세균은 TSA (Tryptic Soy Agar) 배지에 순수분리와 계대배양을 진행하였다.
2.3 세균 동정
순수분리된 세균을 동정하기 위해서 먼저 균총의 형태학적 특징을 해부현미경(BX53; Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 콜로니(colony)의 크기, 모양, 색 등 을 관찰하여 동정을 진행하였다. 세균 세포의 관찰은 Olympus BX51DIC Microscope로 관찰하였다. 분자적 분석을 위해서는 세균을 TSB(Tryptic Soy Broth)에 30℃에서 24 시간 배양 후 마이크로원심분리기 (Centrifuge 5429, Eppendorf Korea)에서 12,000 g 속도로 원심분리하여 세균 침전물을 얻은 후 Direct DNA Prep kit (Navibiotech, Cheonan, Korea)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 16S rDNA region 증폭은 Universal primers인 27F와 1492R를 이용 PCR을 수행하였다(Lane et al., 1991). PCR 증폭산물은 1% Agarose gel 전기영동을 이용하여 목적하는 크기의 DNA band의 유무를 통해 증폭에 성공하였는지 확인하였고(Kwon et al.,2015), PCR Purification kit (Navibiotech, Cheonan, Korea)를 사용하여 정제하였 다. 염기서열 분석은 Macrogen (Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였고, 분석된 세균의 유전자 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 BLAST program을 이용하여 유사도를 확인하고 EZBioCloud program (http://www.ezbiocloud.net/)을 이용하여 동정하였다. 계통분류학적 분석을 위해서 비교할 reference 세균들의 16S rDNA 염기 서열은 GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) database 로부터 다운받아서 다중염기서열정렬을 CLUSTAL W program으로 진행하였다(Thompson et al.,1994). 계통수는 MEGA ver. 6.0 프로그램을 이용하여 작성 하였다(Saitou and Nei, 1987;Tamura et al., 2011. 계통수 가지의 신뢰도 평가는 bootstrap resampling을 1,000번 반복하여 수행하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1 목이버섯 재배사내 온도와 습도
2020년 6월에 선정한 목이버섯 재배사내 온도와 습도를 측정한 결과, 최고 온도는 익산 금마면 재배사에서 35.1℃였고 최저 온도는 완도군 금마면 재배사에서 28.4℃였다(Table 1). 익산 금마면과 완도군 군외면의 온도편차는 1℃를 넘겼지만 완도군 고금면의 온도 편차는 양호한 것을 확인할 수 있다. 반면 습도의 경우 최고 습도는 완도군 금마면 재배사에서 78.5%였고 최저 습도는 익산 금마면 재배사에서 50.3%로, 온도의 측정 결과와 반대의 양상을 보여주고 있다. 완도군 금마면 재배사내 습도 측정결과는 온도와 마찬가지로 편차가 양호하였다. 본 측정 결과는 동일한 완도군 지역임에도 불구하고 재배사의 위치, 주변환경, 관리에 따라 재배 사내 온습도 양상이 다소 다름을 볼 수 있었다. 또한 조사된 재배사내 평균 온습도는 목이버섯 자실체 형성 후 반인 6월 재배사내 온습도 환경으로서 세균이 잘 생장할 수 있는 조건임을 알 수 있다.
3.2 목이버섯 재배사내 부유세균의 농도
재배사내 공기중 부유세균의 농도를 측정하였을 때, 완도군 금마면 재배사에서 2.95×10² cfu/㎥으로 가장 높게 나타났으며 익산 금마면과 완도군 고금면 재배사는 동일하게 1.04×10² cfu/㎥ 로 조사되었다(Table 1). 조사한 재배사 모두 환경부 다중이용시설 실내공기질 부유세균 유지기준인 800 cfu/㎥을 초과하지 않아 양호한 환경으로 나타났다. 보고된 다른 버섯 재배사의 경우를 보면 표고 재배사의 경우 21개 재배사 중 15개 재배사에서 부유세균 유지기준을 초과하였다(Ahn et al., 2017). 느타리 재배사의 경우는 5월에 10°C, 20°C, 25°C 재배실에서 모두에서 실내공기질 유지기준을 초과하였다(Jung et al., 2022). 양송이 재배사의 경우도 3.84 ×103 cfu/m3 수준으로 유지기준을 초과하였다(Kwon et al., 2015). 이는 목이 버섯 재배사의 공기 환경이 다른 버섯 재배사보다 세균 오염도가 낮은 환경임을 보여준다.
3.3 분리된 부유세균 동정
재배사내 공기중 순수분리하여 동정된 세균을 TSA 배지에 접종하여 배양했을 때 콜로니의 형태는 Fig. 2 와 같다. 콜로니의 색과 자라는 형태가 종 간에 차이가 있었다. DIC 광학현미경 관찰시 막대형과 원형의 모양을 가진 세균들이 존재하였다. 이를 16S rDNA 유전자 염기서열을 기반으로 분자적 동정을 진행한 결과 세균은 Bacillus subtilis를 포함하여 총 11속 11종이 동정되었다(Table 2). 분류학적으로 보았을 때, 속(Genus) 수준에서 겹치지 않고 재배사내 공기중 존재할 수 있는 부유세균의 다양성을 보여주고 있다. 이전에 조사된 다른 버섯 재배사의 부유세균을 살펴보면 느타리 재배사에서는15속 20종이 동정되었고, 양송이 재배사에서는 7속 11종, 표고 재배사에서는 33속 76종이 동정되었다 (Jung et al., 2022;Kwon et al., 2015;Ahn et al., 2017). 표고 재배사의 경우 21개의 재배사를 조사한 바 조사 시료수가 많아서 세균이 더 다양하게 검출된 것으로 사료된다. 이러한 자료는 버섯 재배사 공기중에 부유세균이 하고 있음과 더불어 어떠한 종이 부유하는지 알 수 있다.
분자계통도를 분석하여 분류학적으로 어떠한 부유세균이 목이 재배사내에서 우점하는지 살펴본 결과는 Fig. 3과 같다. Micrococcales 5종, Bacilli 4종, Actinomycetia 1종, Mycobacteriales 1종으로 분류되어 Micrococcales가 가장 많이 나타났다. 양송이 재배사 부유세균 조사에서는 Gamma-proteobacteria 가 5종으로서 Beta-proteobacteria 2종, Firmicutes 3 종, Actinobacteria 1종 보다 높게 나타났다(Kwon et al, 2015). 느타리 재배사에서는 Actinomycetia가 7종으로서 Bacilli 6종, Alpha-proteobacteria 4종, Sphingobacteria 1종, Gamma-proteobacteria 1종, Beta-proteobacteria 1종 보다 높게 검출되었다(Jung et al., 2022). 표고 재배사의 경우는 Bacilli 33종으로서 Actinobacteria 24종, Alpha-proteobacteria 2종, Beta-proteobacteria 2종, Gamma-proteobacteria 12, Flavobacteria 2종, Sphingobacteria 2종 보다 높게 분리 되었다(Ahn et al., 2017). 이전에 보고된 다른 버섯류의 재배사에 비하여 proteobacteria에 속하는 종은 목이 재배사에서 보이지 않은 차이를 보였다.
버섯 재배사 부유세균에 대한 조사에서 표고 재배사의 경우 균혈증을 유발하는 Kocuria rosea와 Bacillus licheniformis, 기회감염균인 Staphylococcus xylosus 이 존재한다고 보고가 되었다(Kim et al, 2014). 또 다른 확대된 표고 재배사의 부유세균 연구에서는 Raoultella terrigena와 Staphylococcus cohnii 등 생물안전 2등급에 해당하는 균으로 패혈증을 유발하는 종을 포함하여 10속 15종의 인체 위해성을 지니는 것으로 알려진 균이 존재하였다(Ahn et al., 2017). 느타리 재배사에서는 Agrobacterium radiobacter, Brevundimonas vesicularis, Kocuria palustris, K. salsicia, Lysinibacillus fusiformis, Sphingobacterium siyangense 등의 인체 건강에 영향을 미치는 것으로 보고된 종이 보고되었다(Jung et al., 2022). 양송이 재배사에서는 낭성섬유종과 폐렴을 유발하는 Pseudomonas aeruginosa를 비롯하여 원내감염을 유발할 수 있는 가능성이 있는 균 P. monteilii, 균혈 증을 유발하는 B. licheniformis 가 보고되었다(Kwon et al, 2015). 본 연구에서 조사된 목이 재배사의 경우도 인체 유해성이 알려진 종이 일부 존재하였다(Table 2). 복막염의 유발균인 Cellulosimicrobium funkei와 Rhodococcus kroppenstedtii (Betancourt et al., 2011;Kang et al., 2021), 패혈성 쇼크의 원인균 Micrococcus luteus (Albertson et al., 1978), 심내막염과 괴사성 장염 유발균인 Staphylococcus epidermidis, 알레르기 유발균인 Bacillus subtilus, 인체병원균 Pseudarthrobacter oxydans 등이다(Mollitt et al., 1988). 그러나 버섯 병원균, 버섯 배지 오염균으로 알려진 세균은 존재하지 않았으며 식중독균 또한 존재하지 않았다. 이외에 Curtobacterium oceanosedimentum 를 포함한 식물 생육을 촉진하는 것으로 알려진 세균이 2종 더 존재하였다.
4. 결 론
본 연구는 2022년 6월 국내 목이버섯 재배사 3곳으로부터 재배사내 온습도, 부유세균의 농도를 측정하고 분리 동정을 진행하였다. 조사된 온습도는 3곳 모두 온습도 변화 편차는 양호하였으나 목이버섯 자실체 형성 후반 시기인 6월 재배사내 온습도 환경은 세균이 생장하기에 무리가 없는 조건에 있음을 알 수 있다. 세균의 경우 3개의 재배사 모두 환경부 다중이용시설 실내공 기질 부유세균 농도 유지기준을 초과하지 않았다. 부유세균은 총 세균 11속 11종이 분리 동정되었고 속 수준에서 다양하게 존재하고 있음을 확인하였다. 전체적으로 Bacillus 계통의 세균이 우점을 보였다. 동정된 종 중에서 인체에 영향을 주는 세균은 5종으로 조사되었다. 버섯 재배에 영향을 주는 세균은 검출되지 않았다. 본 연구는 목이재배사 부유세균에 대한 최초의 보고이다. 부유진균 또한 재배사 공기 오염과 환경 위생에 중요한 바 본 연구에서 얻어진 부유세균 정보와 부유진 균에 대한 정보를 더하면 목이버섯 재배사내 환경관리를 위한 좀 더 유용한 미생물 정보가 마련되리라고 사료된다.
